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质粒DNA的提取方法总共有哪些,回答的全给高分???

nishiwodemotou    2009-04-28    质粒提取    浏览 386 次

题目如上,要全的,Z好有详细说明,我会追加给高分的,谢谢。... 题目如上,要全的,Z好有详细说明,我会追加给高分的,谢谢。

精彩问答
妈他好乖 发布日期:2009-04-29
碱裂解法:
此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下:
1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管,以4000rpm离心3min,弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。
7、以10,000rpm离心20min,取上清液于另一新Ep管
8、加入等体积的异戊醇,混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10,000rpm离心20min,弃上清。
10、用70%乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE缓冲液中
煮沸法
1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
酚氯仿裂解法
① 从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆,接种到标准LB培养液中(含有卡那霉素30 μg/mL)摇菌12 h;收集1.5 mL菌液,8000 g/min离心3 min,弃上清,沉淀加入200 μL TE,充分混匀;加入400 μL酚氯仿(1∶1体积)混合液,剧烈振动10 s,混匀;12 000 g/min离心5 min,1 mL胰岛素注射针收集上清,尽量避免吸入蛋白沉淀层;上清经国产0.22 μm针式滤器过滤1次;向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇,振荡10 s,12 000 g/min离心5 min;沉淀溶于20 μL的RTE溶液中,37℃水浴. ② 按PstI内切酶说明书进行酶切反应(37℃,1 h). 酶切产物10 μL,10 g/L琼脂糖凝胶电泳. ③ PCR引物根据参考文献〔1〕设计,预计扩增产物片断大小为714 bp. ④ 常规制备感受态菌E.coli DH5a,提取质粒DNA常规转化感受态,涂于含有卡那霉素(30 μ/mL)LB培养平板中,37℃培养,15 h后观察筛选克隆情况.
碱解法
操作步骤
1、细菌繁殖
LB培养基,2 ml/20ml,37℃,200rpm,摇一摇,过夜
2、离心10 min,5000 rpm, 4℃;弃上淸液
3、沉淀(菌体细胞)预冷的TES缓冲液洗涤,离心10 min,5000 rpm, 4℃
加入预冷的1 ml Solution I,冰浴,10 min
4、重新悬浮,加入150 ul溶菌酶母液,室温放置5 min
5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴,5 min
6、加入0.9 ml预冷乙酸钾,混匀,离心10 min,12000 rpm, 4℃
7、加入1.5 ml异丙醇,-20℃冰箱内放置15 min
8、离心10 min,12000 rpm, 4℃
9、取沉淀,悬于400 ul TE缓冲液中
10、加入40 ul,3 M NaAc
11、酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀
12、离心10 min,12000 rpm, 4℃
13、取沉淀,冷冻干燥,再悬浮于50 ul TE缓冲液中。
14、电泳检测提取DNA的质量
还有碱变性法、SDS法、 羟基磷灰石层析法等
全部评论
美媚帮手 发布日期:2009-04-29
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
仪器、材料与试剂]
(一) 仪器
1、 恒温培养箱
2、 恒温摇床
3、 台式离心机
4、 高压灭菌锅
(二) 材料
1.葡萄糖
2.三羟甲基氨基甲烷(Tris)
3.乙二胺四乙酸(EDTA)
4.氢氧化钠
5.十二烷基硫酸钠(SDS)
6.乙酸钾
7.冰乙酸
8.乙醇
9.盐酸(HCl)
10.Bt菌株
11.吸头、小指管
(三) 试剂
1、 溶液I
50mmol/L 葡萄糖
5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris•HCl
10mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
2、 溶液II
0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合
3、 溶液III
5mol/L乙酸钾 60mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
4、 TE缓冲液
10mmol/L Tris•HCl
(一) 提取质粒
1、 将Bt菌株接种于LB液体培养基中,30℃振荡培养过夜。
2、 取1ml培养物倒入Eppendorf管中,12000r/min离心30sec。
3、 吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。
4、 将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中,剧烈振荡。
5、 加200μL溶液II(新鲜配制),盖紧管皿,快速颠倒5次,混匀内容物,将Eppendorf管放在冰上。
6、 加入150μL溶液III(冰上预冷),盖紧管口,颠倒数次使混匀,冰上放置5min。
7、 12000r/min,离心5min,将上清夜转至另一Eppendorf管中。
8、 向上清夜加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5~10min。12000r/min离心5min。倒去上清夜,把Eppendorf管倒扣在吸水纸上,吸干液体。
9、 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清夜,真空抽干或空气中干燥。
10、50μL TE缓冲液,使DNA完全溶解,-20℃保存
这下边应该全点
晓豸 发布日期:2009-04-29
碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下:
1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管,以4000rpm离心3min,弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。
7、以10,000rpm离心20min,取上清液于另一新Ep管
8、加入等体积的异戊醇,混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10,000rpm离心20min,弃上清。
10、用70%乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE缓冲液中

煮沸法
1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
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