如何去除质粒提取中的RNA杂质质粒DNA琼脂

hanyes475 2017-10-08 质粒提取浏览 1490 次

精彩问答

baby墨情86 发布日期：2017-10-09

现在质粒提取无论手提还是试剂盒，其根本原理大多还是碱裂解法:当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。进一步的质粒DNA获取，手提是经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA以及过多的盐分，而试剂盒则在此基础上使用DNA吸附柱来吸附质粒DNA，在洗脱得到质粒。评价:1，可通过琼脂糖电泳来检查所获质粒的大小(准确大小需酶切)，有无细菌基因组DNA和RNA污染，以及质粒的断裂多少，同时也可根据marke量对样品进行大致的浓度定量;2，通过紫外分光光度计测定样品OD280和OD260，计算其比值来衡量样品的纯度。经验值:纯DNA:OD260/OD280≈1.8(＞1.9，表明有RNA污染;＜1。6，表明有蛋白质、酚等污染)。同时，用紫外分光光度计对其进行精确浓度定量。去除蛋白质:如上所言，提取质粒过程中，一部分蛋白质会在碱裂解法中形成沉淀，得以去除;还有更多不能形成沉淀的蛋白质在用酚/氯仿/异戊醇进行抽提的过程中被去除。若有疑问，欢迎继续讨论，祝愉快!

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