培养基装管装瓶(袋)后，应立即进行消毒灭菌，如灭菌不彻底，就容易产生杂菌，给生产造成损失。
(一)母种培养基灭菌法
母种培养基灭菌一般用手提式高压锅。灭菌时将试管7～10支扎成一捆，再用防潮纸或牛皮纸包住试管棉塞，管口朝上，防止灭菌时棉塞潮湿。高压灭菌的时间，在1.2kg～1.5kg/cm2压力下保持15～20分钟即可。但在使用高压锅灭菌时还应注意如下事项：
1.灭菌时锅中水要放至水线为止。如放水过少易引起烧干及烧焦培养基；如放水过多，棉塞易潮湿，以后易感染杂菌。
2.锅内的冷空气必须排除干净，否则达不到灭菌的温度。排除锅内冷空气的方法有两种，一是将灭菌锅升火后，从开始出气起，经5分钟左右的排气，至从排气阀出的气达到直喷时，再关闭排气阀；另外一种是将排气阀关闭升火，待压力升到0.5kg/cm2时，打开排气阀，使指针降落到“0”后，再关闭气阀，烧至所需压力。
3.灭菌时间不易过长或过短，过长养分易被破坏，培养基颜色发黄，对菌丝生长不利；过短则达不到灭菌的效果。灭菌结束后，放气速度不能太快，宜逐渐进行，使指针慢慢下降到“0”，才揭开锅盖，否则棉塞容易冲出试管。
在没有高压锅的条件下，可以用土蒸汽锅灭菌，但要相应延长灭菌时间，在100℃下的温度应保持4～6小时。为了灭菌彻底，可采用间歇灭菌法，每天水烧开后蒸煮1小时(100℃)，连续三天。
培养基灭菌结束后，应立即取出试管直立放置2～3分钟，待试管壁上的水珠回到培养基内后，再趁热搁置斜面。这样，试管壁上不会有大量的水珠，温度适当。斜放时，一般使斜面为试管总长的二分之一至三分之一。放好后，再用纱布覆盖，防止冷却过程中因温度急剧变化而使管壁形成水珠。
经灭菌后的斜面试管，必须在接种前于每一批或每锅中取出3～4支，放在28℃～30℃的恒温箱中培养2～3天作空白试验。经培养后，斜面仍光洁透明，无杂菌或细菌出现，则表示灭菌彻底，可作接种用。如发现杂菌，则应找出原因，并将这批试管重新灭菌一次后方可使用。
(二)原种、栽培种的高温灭菌
原种、栽培种所需的数量多，灭菌一般采用较大的灭菌锅。采用高压蒸汽锅进行湿热灭菌时，升温火力应逐渐加大，以防锅内温差变化太大，引起玻璃瓶炸裂破损。当压力开始升到0.5kg/cm2时，即打开排气阀排出冷气，待冷空气放尽后，再关上排气阀重新升温，烧至所需压力。
高压灭菌所需要的时间，应根据培养基原料的种类和生熟程度来决定长短。木屑、棉壳、蔗渣和种木为主料的培养基灭菌时的蒸汽压力要求达到1.5kg/cm2，保持60分钟；稻草培养基和粪草培养基，在同上的压力下，保持90分钟；而麦粒培养基则要保持120分钟，才能达到灭菌效果。
采用土锅灭菌时，在98℃～100℃的温度下，需连续灭菌6～8小时；麦粒培养基的灭菌时间须达12小时为宜。停火后再焖蒸3～4小时才能出瓶(袋)。
采用塑料薄膜袋装菌种培养基灭菌时，可按以上方法进行灭菌。聚乙烯耐压，耐温性能差，故只能采用常压灭菌，100℃保持8～12小时。聚丙烯塑料薄膜耐温、耐压性能好，可在1.5kg/cm2压力下保持2小时，灭菌彻底且不会破裂。灭菌后不要立即打开锅盖，待温度下降至50℃时趁热开锅取出，这样可减少每包粘连一起的现象。
培养基灭菌完毕从锅中取出后，应放于清洁、凉爽、干燥的室内进行冷却待接，并在棉塞上喷5%石炭酸或0.25%新洁尔灭溶液，以防杂菌感染。
