“RT-PCR扩增目的基因cDNA”需要注意的事项有哪些?

RT-PCR 是将 RNA 的反转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结 合的技术。
首先经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA，再以 cDNA 为模板， 扩增合成目的片段。

RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基 因表达水平，细胞中 RNA 病毒的含量和直接克隆 特定基因的 cDNA 序列。
作为模板的 RNA 可以是总 RNA、mRNA 或体外转录的 RNA 产物。无论使用何 种 RNA，关键是确保 RNA 中无 RNA 酶和基因组 DNA 的污染。
RNA 的反转录过程遇到的问题
1． 在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取 过程中，注意避免 mRNA 的断裂。
2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对 照。
3． 内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD（甘 油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免 RNA 定量 误差、 加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成 的误差。
4． PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长 度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现 平台效应的循环数， 均应通过单独实验来确定。
5． 防止 DNA 的污染：（1） 采用 DNA 酶处理 RNA 样品。