流式细胞仪如何设置凋亡阳性对照

随风飘飘絮 2016-04-16 流式细胞仪浏览 917 次

本人现在要做流式细胞，做的内容是TNF-α诱导细胞凋亡，用的方法是Annexin V+PI，请问如何设置阳性对照和阴性对照？新手，请说的越详细越好，或有相关资料发给我也行！谢谢！cxxxf@qq.com

精彩问答

叶叶悠然发布日期：2016-04-16

1、必须活细胞检测，不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜.
2、特殊细胞的染色方法：在消化或吹打时，有些细胞（如神经元细胞）很容易受到损伤，导致晚期凋亡或坏死比例非常高，不能反映真实结果.实验的解决方法：先低速离心，吸取细胞培养板中的液体，留少许液体，加入适量PI和Annexin-V染色10min后，将漂浮细胞吸至离心管中，离心洗涤两次，用PBS漂洗贴壁细胞两次，加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中，离心洗涤，再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测.应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例，增加早期凋亡细胞比例.
3、由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白，只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大，因而在消化细胞时，建议一般不采用含EDTA的消化液.
4、必须设置阴性对照和补偿对照（分别单染）.

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py平民发布日期：2016-12-01 23:17:23

你的阴性对照就是无任何染色的细胞。
PI阳性对照，可以固定过的死细胞，可以保证都是PI阳性
Annexin阳性的细胞，用trypsin消化时间长一点（比如消化10分钟），大部分也是阳性的。这个也从一个侧面反映出该方法（Annexin V+PI）的非特异性很高。

上机先用阴性对照设置PMT的电压和gate。再用PI和Annexin单染的阳性细胞调节compensation。然后就可以检测双染的样本了。

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