回放来了！还有细胞培养技术答疑，赶紧看！

3月13日，瑞沃德首期

细胞培养技术线上课程圆满结束

相信大家对细胞培养有了进一步了解

直播间学员互动超积极

此次我们在直播中开启了多轮抽奖

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直播回放来了

       很多小伙伴直播一结束就问在哪可以回看，看来这次培训干货满满，大家都期待再看一次。经过整理，热腾腾的回放链接来了！识别下方二维码，点击关注，回复“回放”，即可获取细胞培养技术线上课程！

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精选答疑

       对于大家在直播中提出的问题，我们进行了整理，并邀请讲师为大家进行统一答疑，快来看看你的问题解决了吗？

1 如何判别细胞是否被支原体污染？

       熊博：这一部分我们课程中有讲，如有需要大家可以先回看视频了解。

       支原体很小，大小介于细菌和病毒之间(直径在0.13～0.18μm)，且共生在细胞内，无法用肉眼或光学显微镜直接观察到。一般在培养细胞的过程中发现细胞状态不好（如出现生长减慢，细胞病变等），同时又通过镜检观察排除了真菌和细菌污染的可能，往往这时候需要考虑是否是支原体污染。通常的检测方法有几种，基于不同的原理，准确度也有一些差异。

       ● DNA结合荧光素染色法：利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst 33258）侦测支原体污染。荧光染料会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。

       ● PCR法：通过PCR扩增支原体内特异的DNA片段，电泳查看结果来检测确定是否支原体感染。

2 孩子高烧40度，会不会损伤很多细胞？

       因为上次回答时间有限，这次特详细解答，大家一定要记住啦。

       熊博：一般来说发烧是机体对抗病原体的正常生理反应，短时间的高烧不会对机体造成不可逆的损伤。我们PPT里介绍了细胞对高温的耐受性比较低，但是短时间的40度高烧，对细胞的损伤还是可逆的，细胞一般不会大批量死亡；当恢复正常体温时细胞可以逐渐修复。但是持续性的高烧40度以上还是有很大危险，需要及时ZL。

3 反复离心对细胞有损伤，是否有更好的细胞清洗办法？

       熊博：为了减少损伤，通常我们会选用较低的转速以及圆底的离心管来离心。特殊情况可用小于细胞直径的过滤膜，然后加入PBS进行清洗。Z后将滤膜反过来加入培养基进行冲洗，这样可以收集到细胞。滤膜是细胞培养基础耗材，过滤常会用到，一般供应商都会有供应。但是此方法会损耗一部分细胞黏附在膜上，一般不建议。  

4 细胞计数时，稀释度如何确定？

       熊博：细胞计数前一般都需要先稀释，浓度不能太高也不能太低，据经验，每个大格内细胞Z好不要超过一百个，相当于加入细胞计数板的浓度不要超过1×106个/mL。可以先稀释计数看看，浓度过高再加若干倍稀释，或直接做个梯度稀释。每大格控制在50个左右Z好。计数没经验的话，需要计数好几次。如果有经验，可以先预估细胞总量，比如293T细胞长满10cm培养皿底面积是60cm²（常用培养皿或培养板的底面积大家要留意记住，经常会用到）大致是1×107个细胞，全部离心重悬后可以估计出浓度值，如重悬于1mL培养液则须稀释大约20倍左右进行细胞计数板计数，若过密或过疏再微调浓度。

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5 过期的血清会产生细菌吗？

       熊博：血清的保质期一般是5年。如果正确保存，过期的血清不会产生细菌，但是营养物质很有可能会降解，会影响细胞培养效果。

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6 用5% DMSO+20%FBS的细胞冻存液，也能让细胞正常复苏，相比10%DMSO+20%FBS，这个比例有没有不妥的地方？

       熊博：细胞冻存过程中DMSO能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶形成，从而减少冰晶造成的细胞损伤。10%DMSO是经验总结的比例，如果您说的5%也可以满足条件，说明细胞系比较皮实，但是还是建议10%的比例，另外，如果条件容许 10%DMSO+90%血清可以更好的保护细胞。

       答疑就到这里了，大家有其他问题，可以在交流群内提问，或者添加小助手解答（在公众号回复：细胞，添加小助手）。下期细胞培养技术线上课程正在火热筹备中，同时我们为大家准备了一系列好玩的活动，大家记得实时关注哦！