TaqMan探针法因其良好的特异性以及可多重检测而受到实验人员的青睐,其实除了探针法外,还有很多好的实验方法也被实验人员广泛认可,这次就介绍一下另一个应用广泛的方法:SYBR Green染料法,它又是因为哪些优点获得实验人员的青睐呢?
染料法原理
染料法一般使用的是SYBR Green I染料,这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料,其不会与单链DNA结合,且在游离状态下几乎无荧光,只有与双链DNA结合才会发出荧光,因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联,产生实时监测的效果。
SYBR Green染料法优点
☑ 通用性好,适合进行大多数类型的定量反应,可以进行熔解曲线的分析。
☑ 无需设计探针,引物设计相对简单,不用考虑基团选择,易于上手;成本低,无需合成探针。
☑ 无需PCR后处理,减少分析工作量并节省材料成本。
SYBR Green染料法缺点
SYBR Green染料法也有其缺点,SYBR Green染料法一个反应只能检测一个基因,无法进行二重甚至多重的实验。同样的相对于TaqMan探针法其特异性较差,当引物存在二聚体或者非特异性扩增时,染料同样可以结合并发出荧光,影响定量结果。因此对于SYBR Green染料法而言,设计一套好用的引物是重中之重。
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设计好引物后,我们该怎么进行实验呢?
1.实验条件的优化
我们需要对设计的引物扩增效果进行分析,使用阳性模板进行扩增,确定扩增产物为单一条带,且大小符合设计预期,如有条件可以对扩增产物进行测序,保证准确性。当引物无问题后,进行反应条件的探索,对退火温度进行温度梯度检测,找到合适的退火温度,即PCR扩增效果好,阴性模板无扩增,条带单一,熔解曲线单峰等。
2.预实验
设计好引物并探索好实验条件后,对样本进行一次预实验,预实验将样本进行梯度稀释用以制作标准曲线,分析内参基因以及目的基因的扩增效率是否接近且在100%左右,其次可确认高浓度模板中是否有yizhi剂干扰,从而确定实验时合适的模板浓度(样本是否需要稀释或浓缩)。
3.正式实验
当我们完成了实验条件和预实验后就可以进行正式实验了,每个样品都需要3个或以上的重复,保证结果的准确性。
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