摘要
•微波增强的多肽固相合成(SPPS)能够快速有效地进行大体积氨基酸(如Aib和N-Me-A)的常规困难偶联
• 酰基载体蛋白衍生物VQAibAibIDYINGOH和VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的合成在2小时内完成,纯度分别为95%和86%
• GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2的合成在3小时内完成,纯度为 89%
介绍
在许多生物学相关的化合物中都可以找到受阻的非标准氨基酸,例如α-氨基异丁酸(Aib)和N-甲基丙氨酸((N-Me)-A)(图1)1-3。然而,包括Aib或N-甲基化氨基酸的肽合成已被证明具有挑战性;第二个甲基引入的空间位阻,无论是在α-碳还是酰胺氮上,都使这些氨基酸衍生物在传统SPPS中难以偶联。
图1 位阻、非标准氨基酸
然而,通过使用微波增强的SPPS,与受阻非标准氨基酸相关的困难已被最小化。在SPPS中使用微波能量可以快速有效地完成大体积氨基酸(如Aib和N-甲基丙氨酸)的常规困难偶联4,5。
材料和方法
试剂
N-α-Fmoc-α-氨基异丁酸获自AnaSpec(Freemont,CA)。Fmoc-N-Me-Ala-OH获自Peptides International(Louisville,KY)。所有其他氨基酸均获自CEM Corporation(Matthews,NC),并含有以下侧链保护基团:Asn(Trt)、Asp(OMpe)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Ser(OtBu) 和Tyr(tBu) 。Oxyma Pure和Rink Amide ProTideTM LL树脂购自CEM Corporation(Matthews,NC)。N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)获自CreoSalus(Louisville,KY)。Fmoc-Gly-Wang Resin LL购自NovaBiochem(St.Louis,MO)。哌啶获自Alfa Aesar(Ward Hill,MA)。三氟乙酸(TFA)、3,6-dioxa-1,8-octanedithiol(DODT)、三异丙基硅烷(TIS)和乙酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙 醚(Et2O)购自VWR (West Chester,PA)。HPLC级水(H2O)和HPLC级 乙 腈(MeCN) 购 自 Fisher Scientific (Waltham, MA) 。
多肽合成:GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2
使用CEM Liberty Blue™自动微波肽合成仪在Rink Amide ProTide LL树脂(离子交换容量:0.18meq/g)上以0.1mmol规模制备多肽。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中进行脱保护。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍过量的Fmoc-AA-OH进行偶联反应。使用具有TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系统进行切割。裂解后,肽在无水乙 醚中沉淀并冻干过夜。
多肽合成:VQAibAibIDYING-OH
使用CEM Liberty Blue自动微波肽合成仪在FmocGly-Wang LL 树脂(离子交换容量:0.33meq/g)上以0.1mmol规模制备。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中进行脱保护。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍过量的Fmoc-AA-OH进行偶联反应。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系统进行切割。裂解后,肽在无水乙 醚中沉淀并冻干过夜。
多肽合成:VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH
使用CEM Liberty Blue自动微波肽合成仪在FmocGly-Wang LL 树脂(离子交换容量:0.19meq/g)上以0.1mmol规模制备肽。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中进行脱保护。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍过量的Fmoc-AA-OH进行偶联反应。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系统进行切割。裂解后,肽在无水乙 醚中沉淀并冻干过夜。
多肽分析
在配备有PDA检测器的Waters Acquity UPLC系统上分析肽,该检测器配备Acquity UPLC BEH C8柱(1.7mm和2.1x100mm)。UPLC系统连接到Waters 3100 Single Quad MS用于结构测定。在Waters MassLynx软件上进行峰分析。使用(i)H2O和(ii)MeCN中的0.1%TFA梯度洗脱进行分离。
结果
在Liberty Blue自动微波肽合成仪上GEQKLGAibAibAibAibASEEDLG-NH2的微波增强SPPS产生了89%纯度的目标肽(图2)。
图2.GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2的HPLC色谱图
在Liberty Blue自动微波肽合成仪上的VQAibAibIDYING-OH的微波增强SPPS产生了纯度为95% 的目标肽(图3)。
图 3:VQAibAibIDYING-OH的HPLC色谱图
在Liberty Blue自动微波肽合成仪上的VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的微波增强SPPS产生了纯度为86%的目标肽(图4)。
图 4:VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的HPLC色谱图
结论
微波增强的SPPS能够快速有效的进行大体积氨基酸(如Aib和N-Me-A)的常规困难偶联。常规合成GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2需要40小时且纯度< 10%,但微波增强SPPS在3小时内产生目标肽且纯度为89%。此外,酰基载体蛋白衍生物VQAibAibIDYING-OH和VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的合成在2小时内完成,纯度分别为95% 和86%。微波增强的SPPS已被证明是一种有效的工具,可以最 大限度地减少SPPS中受阻的非标准氨基酸相关的困难。
参考文献
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