AccuSizer 颗粒计数器用于蛋白质配方筛选和 USP <787> 测试

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AccuSizer® 自动颗粒计数分析仪可用于蛋白质配方优化，最 大程度地减少蛋白质聚集并执行 USP <787> 亚可见颗粒物质测试。

简介

动态光散射 (DLS) 是检测蛋白质粒径的标准工具，但该方法不提供浓度信息。AccuSizer® 单粒子光学传感技术 (SPOS) 系统可用于检测聚集蛋白粒径和浓度，可测量150nm以上的聚集蛋白浓度。图 1 显示了单抗产品热应激前后的 Nicomp® DLS 结果。

加热后的结果（蓝色）显示了高分辨率的多峰结果，包括从~150 nm开始的较大的聚集峰。AccuSizer 无法检测到 10 nm 的颗粒，但可以提供 >150 nm聚集蛋白的定量数据。在这项研究中，AccuSizer FX Nano 用于研究各种配方稳定化学物质如何影响NIST标准蛋白质的最 终聚集状态。AccuSizer FX Nano也可用于 USP <787> 亚可见颗粒物测试1。

材料

使用的蛋白质是 NIST 标准物质 8671，批号 14HB-D002，NIST mAb，人源 IgG1k 单抗2。在Nicomp动态光散射(DLS)系统上，使用35mw激光二极管源，APD检测器测量蛋白质的初次粒径。在配备两个传感器的AccuSizer FX Nano SIS系统上测量蛋白质聚集体:LE-400; 0.5 – 400 μm 和 FX Nano; 0.15 – 10 μm.SIS进样器提供精确的样品体积，最 小进样量低至100 μL且可回收。

iFormulate3（图 2）板预装了配方，由 DoE 设计用于合理的配方开发，用于测试配方的聚集水平。评估了蛋白配方的四个主要影响因素；pH、离子强度、缓冲液和稳定剂浓度。

使用的 iFormulate 板测试了以下影响因素：

• pH：5 – 7.6

• 离子强度：0 – 200 mM NaCl

• 海藻糖稳定剂：0 – 10 %

• 缓冲液浓度：10 – 50 mM

方法

将 NIST mAb 解冻并稀释至 1 mg/mL，将 160 μL 过滤的去离子水添加到 iFormulate 板的每个孔中。每孔加入40 μL NIST mAb。将培养皿置于60°C(刚好低于蛋白质熔点)的烤箱中24小时。使用 AccuSizer 颗粒计数器分析每个孔。将>0.15 μm(总)和>0.53 μm的颗粒计数数据提交给iformula，由iformula进行数据分析和稳定性建模。

结果

数据使用帕累托分析方法处理，帕累托分析方法在多影响因素下十分有效。帕累托分析给出了影响因素排名和影响因素之间的相互作用。图 3 和图 4 分别显示了 >0.15 μm 和 >0.53 μm 的帕累托分析。颜色表示配方变量对增加的颗粒计数的相对重要性，蓝色 = 重要，灰色 = 临界，红色 = 不太重要。

下面的结果显示了不同条件下聚集效应的 3D 响应曲面图。这种设计空间提供了通过检测在两个粒径范围内颗粒浓度的方法，以此来确定可最 大限度减少聚集配方。图 5 和图 6 显示了在保持缓冲液和 NaCl 浓度不变的情况下，改变 pH 值和稳定剂（海藻糖）的结果。

图5 pH值和稳定剂的影响>0.15μm

图6 pH值和稳定剂的影响>0.53μm

图 7 和图 8 显示了不同 NaCl 和稳定剂（海藻糖）浓度的结果，同时保持缓冲液浓度稳定且 pH 值从 5.91 略微变化到 6.3。

图7 NaCl和稳定剂的作用>0.15μm

图8 NaCl和稳定剂的作用>0.53μm

然后对这些结果以及此处未显示的其他结果进行整理，图9和图10显示了最 小粒子数优化图。

图9 颗粒最 小化图>0.15μm

图10 颗粒最 小化图>0.53μm

结论

此处显示的结果表明，可最 大程度减少颗粒计数并因此减少蛋白质聚集的最 佳化学制剂为：

pH = 6.1 – 6.3

NaCl = 40 – 70 mM

海藻糖 = 7 – 8%

缓冲液 = 50 mM

AccuSizer也可用于在≥10和25μm的条件下进行USP＜787＞测试，并可使用A2000 USP微孔板分析仪实现自动化。

氢（H）和氧（O）—— 两种简单的元素组成了是世界上最重要的分子之一水（H2O），它在地球上无处不在，对我们的健康和生存也至关重要。通常情况下，它含有其他离子，如钙、镁和氯化物，这些离子对人体的功能也非常重要。但是，在一些特定情况下，比如制备医疗使用的注射剂或者其他溶液，就需要使用超纯水。

那么怎样来确保超纯水的质量呢？

美国药典 USP<645> 给出了答案，在该标准中说明了如何确定其电导率及如何进行分析。

在此过程中首先需要测量电导率和 pH 值的仪器。瑞士万通推荐使用 Aquatrode plus pH 电极和电导电极。

Aquatrode plus 为复合pH玻璃电极，适用于低电导率和缓冲能力弱的样品，如超纯水；反应时间迅速；具有双层结构，可以自由选择参比溶液来适用各种特殊应用。

电导电极，带池常数 c=0.1cm-1，适用于测量较低的电导率（0 至 300µS/cm），例如去离子水等。内置温度传感器，因此测量温度不再需要额外的电极。

USP <645> 测定步骤

01  电极校准。pH 电极用 pH=4 和 pH=7 的缓冲溶液进行校准；电导电极使用 100µS/cm 的标准缓冲溶液进行校准。

02  电极校准后，无需温度补偿即可测量温度和电导率。测量得到电导率数值如果低于 USP<645> 中的值，则满足要求，测量的水样可以用于医疗等用途。相反，则需要进行下一步。

03  将 100mL 的水转移至外部滴定容器中，将温度调节至 25±1℃。剧烈的搅拌水样使其吸收空气中的CO2，然后进行测量。当电导率在5分钟内的变化不超过 0.1µS/cm 时，记录数值进行评估。此时的电导率如果低于 2.1µS/cm，测量的水样可以用于医疗等用途。相反，则继续进行下一步。

04  温度控制在 25±1℃，加入 0.3mL 饱和 KCl 溶液，测量水的 pH 值。pH 值如果介于5和7之间，电导率对应了 USP<645> 中的值，则分析通过，测量的水样可以用于医疗等用途。如果 pH 值没有介于5和7之间，则水样不符合要求，需要舍弃。

USP <645> 的自动化

多步骤的分析非常耗时，为了解决这一问题，瑞士万通提供了一种自动化解决方案，我们的系统将所有步骤组合成一种方法，实现无人值守的自动化分析，使得您可以将精力放在其他更重要的任务上。

815 型机器人样品处理器自动分析样品

856/867 模块 (精确测量 pH 值和电导率)

◇ Aquatrode plus 测量准确的 pH 值

◇ 电导电极测量低电导率

◇ 恒温容器

◇ 样品瓶盖防止样品吸收CO2（第三步之前）

◇ 搅拌器，使溶液充分吸收CO2

瑞士万通自动化解决方案，使USP <645> 分析超纯水（UPW）的质量以全自动和可靠的方式进行。在每次分析结束时，如果超纯水 (UPW) 通过测试，则会收到清晰的消息提醒。处理非常简单，用户只需看一眼即可知道分析是否通过。

简介和挑战 

       制药行业严重依赖于塑料包装材料，以将产品推向市场。药品的包装材料包括瓶子、一次性使用的袋 子（例如静脉输液、血液或其组分的输液袋）、预 充式注射器等，包装材料中可能含有多种成分（各 种聚合物和添加剂）。必须证明这些包装材料（及 其结构材料）不会与药品发生反应，从而影响药品的适用性。 近来，USP <661>章经过修订，适用范围更加全面， 能够用于验证各种包装材料和包含多种材料的包装 系统。 

USP 的总有机碳（TOC）法规 

       USP 要求对纯化水（Purified Water ，PW）和注射用水（Water for Injection ，WFI）进行 TOC 测试， USP <643>章对此有完整的说明。纯化水和注射用水的 TOC 限值设定为 0.5 ppm。 

       2016 年 5 月 1 日， USP <661>总章有了重大修订， 此章标题重定为“塑料包装系统及其结构材料 （ PLASTIC PACKAGING SYSTEMS AND THEIR  MATERIALS OF CONSTRUCTION）”。另外，总章 的 2 个分节为：

• <661.1>塑料结构材料（Plastic Materials of  Construction） 

• <661.2> 制 药 用 塑 料 包 装 系 统 （ Plastic  Packaging Systems for Pharmaceutical Use） 

法规除了描述材料和系统之外，还提出了更广泛的测试方法和技术，其中包括 TOC 测试。 

       如上所述，这是为了使用户了解包装系统和包装本 身所使用的材料。因此，修订的法规对行业运营产生了深远影响，目前适用于：

• 成品药制造商 

• 塑料袋、瓶、输液器具等的制造商包装药品的监管批准者负有达到本法规要求的主要职责。

USP <661>分节 

<661>有两个分节： 

<661.1>塑料结构材料。本节旨在确保各种材料符 合适用性。本节专用于各种塑料材料。 

<661.2>药品用塑料包装系统。本节旨在确保含有 一种或多种材料的整个包装系统符合适用性。

661 的预期评估 

材料筛选 

• 评估可能的可萃取物和潜在的可浸出物的成分 控制条件下的萃取研究 

• 进行Z坏情况的受控的萃取（模拟）研究，确定萃取物变成可能的可浸出物的程度 

产品评估 

• 对于将要推向市场的包装/输送系统中的药品， 对已确认的可浸出物进行实际测量

661 的 TOC 限值

满足 USP <661>法规的其他 TOC 要求 

进行的 TOC 分析： 

• 应有 0.2 ppm 检测限 

• 应有 0.2 - 20 ppm 线性动态范围

Sievers M9 TOC 分析仪与满足 USP <661>的要求

       Sievers M9 总有机碳（TOC）分析仪提供良好的可 靠性和快速分析性能，此优越性已经过时间的检验。 分析仪能够将 TOC 结果的报告时间缩短 50％，从 而提高了生产效率。 

       Sievers TOC 分析仪能够帮助在严格监管的环境下 运营的企业达标，仪器的性能超过了法规和分析要 求。分析仪的线性范围广，对超纯水样品的低浓度 具有高灵敏度，对清洁验证样品的高浓度检测能力也很强。

       M9 分析仪的线性范围为 0.03 ppb - 50 ppm，有效 地达到了 USP <661>对检测限和动态线性范围的要求。所有的 Sievers TOC 分析仪都符合纯化水和注 射用水的 USP <643>要求。

为了支持分析仪和 USP <661>合规性，我们提供 NIST 可追溯标样和 ISO Guide 34 与 ISO/IEC 17025 的认证标样：

• 准确度/精确度标样组，8 ppm (STD 770131) 

• 准确度/精确度标样组，5 ppm (STD 99011) 

• USP <661>线性标样组 (STD 99012) 如有要求，我们还提供线性协议和电子表格以供参考。 

       上述标样，结合 Sievers 的故障调查分析报告 （Failure Analysis Report，FAR），提供了可追溯 性和快速“不合规（Out of Specification ，OOS）” 调查。 

       M9 分析仪有实验室型和便携式两种，便于使用。分析仪符合 USP <643>、USP <645>、USP <661>、 USP <1225>、21 CFR Part 11 等法规要求，包括国际同类标准要求。

参考文献 

1.USP <661>总章 

2. USP <661.1>和<661.2>分节 

3. USP 661 简报： http://www.usp.org/sites/default/files/usp_pd f/EN/meetings.pdf

颗粒计数器是工业、环境监测、电子制造等领域中不可或缺的设备，它能够准确检测和计数空气或液体中的颗粒物，帮助企业确保产品质量、符合标准和环境安全。为了确保颗粒计数器的度和可靠性，定期校准是必不可少的。本文将详细介绍颗粒计数器的校准过程，探讨校准的重要性，并为您提供实用的校准步骤和注意事项，帮助您提高颗粒计数器的工作效能和测量精度。

颗粒计数器校准的必要性

颗粒计数器的主要功能是测量空气或液体中的微小颗粒物数量，而这些颗粒物的大小、形状及浓度对测量结果有着至关重要的影响。若计数器长时间未经过校准，可能会导致测量误差，影响产品质量检测的准确性，甚至可能带来不合格的产品或不符合法规的环境数据。因此，颗粒计数器的校准不仅有助于确保设备性能，还能保证测试数据的准确性和可靠性。

颗粒计数器的校准流程

1. 确认设备状态在进行校准之前，首先需要检查颗粒计数器的工作状态。确保设备的电源、传感器、管道等部分都完好无损，无任何机械故障或软件错误。
2. 选择校准标准根据颗粒计数器的使用场景（例如空气质量监测或液体颗粒计数），选择合适的校准标准。通常，颗粒计数器校准标准包括国家或行业规定的标准颗粒物浓度，或者使用经过认证的标准气体或溶液进行对比。
3. 记录和验证结果校准完成后，应对校准数据进行记录和验证。通过多次测试确认设备的测量结果与标准值一致，并进行必要的调整。如果发现偏差超出允许范围，可能需要对设备进行更深入的检查和维修。
4. 后期监控和复校颗粒计数器校准只是一个周期性的过程，之后还需要定期监控设备的运行情况，确保其在实际使用中持续保持高精度。在一定时间后，应根据设备的使用情况重新进行校准，保持设备的长期可靠性。

校准过程中需要注意的事项

• 定期校准：颗粒计数器应定期校准，尤其是在设备使用频繁或测量精度要求较高的环境下。具体校准周期可根据设备使用频率和制造商的建议进行安排。
• 环境因素：校准过程中要确保测试环境稳定，避免温度、湿度等因素对测量结果产生干扰。
• 专业培训：操作人员应经过专业培训，确保具备必要的技术知识，能够正确操作校准设备并进行问题排查。

结语

颗粒计数器的校准是确保测试精度、保证设备长期稳定运行的基础工作。通过定期校准，不仅能提高测量结果的可靠性，还能为企业的质量控制、环境保护等方面提供科学依据。为了达到佳的校准效果，建议选择专业的校准服务，或根据行业标准自行进行规范操作，从而有效提升颗粒计数器的性能和精度。