共聚焦荧光成像与单细胞分选技术联用，揭示肠道菌群的分裂模式及种属分类-仪器网

共聚焦荧光成像与单细胞分选技术联用，揭示肠道菌群的分裂模式及种属分类

来源：长春长光辰英生物科学仪器有限公司分类： 2024-08-30 16:00:10 40阅读次数

了解不同肠道细菌在体内的过程和活性，有助于理解微生物功能及其与宿主的相互作用。尽管人们对肠道菌群复杂功能的认识进展迅速，但直接研究单个细胞的体内微生物活性和过程仍然具有挑战性。

有研究团队提出了一种综合策略，将共聚焦荧光成像技术与单细胞分选和测序相结合，对共聚焦下呈现特异荧光信息的感兴趣细菌进行直接分选和测序，无需体外培养即可同时获得单细菌基因信息和生长分裂表型信息。鉴于这一方法的普适性，其有望成为各类复杂细菌体系研究中一种重要的通用策略。

该策略首先利用能够代谢标记肽聚糖的D型氨基酸荧光探针（FDAA）作为工具，通过使用红绿两种FDAA探针对小鼠进行序贯灌胃，在体标记后获得带有双色荧光的肠道菌群（两种颜色在细菌上的分布可反映其分裂情况）。然后将样品加到带有坐标信息（可进行定位）和特殊涂层（用于激光弹射分选）的芯片上，风干后进行共聚焦成像并记录感兴趣细菌的位置。之后将芯片转移到单细胞分选仪，把相应细菌挑选到无菌管内，破壁后利用MDA进行DNA扩增，用于后续的16S rDNA和全基因组测序分析。作者将这一方法命名为FLCiSS（combining fluorescent probe labeling and confocal imaging with single-cell sorting and sequencing）（图1）。

图1. FLCiSS流程图

为了确定FLCiSS的实用性，研究者首先在人工细菌群落中测试了该方案，该细菌群落包含一株大肠杆菌(K12)和一株枯草芽孢杆菌(CICC 23659)，分别用FADA和Cy5ADA预标记。基于荧光信息，每种细菌分选30个单细胞并进行全基因组扩增和测序。FLCiSS在单细胞水平上鉴定大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的成功率分别为73.3%(22/30)和33.3%(10/30)，这与最近单细菌测序研究中报道的一些最佳比率相当。综合这些数据，证明了FLCiSS在提供单个细菌的荧光标记数据和分类鉴定方面的可行性。

图2 FLCiSS方案中FDAA标记的肠道微生物群共聚焦荧光成像

依次为FADA（绿色）标记、Cy5ADA（红色）标记、明场、双荧光联合通道下的小鼠的盲肠微生物成像，比例尺= 2 μ m

按上述方法共选择了210个细胞进行成像，同种生长模式的细胞进行单细胞分选，并经MDA扩增，成功扩增90个单细胞样品。对其中59份样品进行16S rDNA进行测序，确定各样品的分类群；其中48个样品得到NCBI的鉴定，另外11个样品无法被分类，疑似为过去研究中未培养的细菌类型。

图3肠道微生物代表性荧光图像及细胞分选明场图

Anaerotignum属、 Butyricicoccus属和Lachnospiraceae门的3个细菌，其绿色信号分布于两端 (图3A-C)，提示其可能为二分裂细菌；

Flavonifractor属的一个细菌，两种信号在两端的分布不对称（图3D），提示其可能刚完成分裂（一端的红色信号来自母细胞septum上的标记）。

对一个具有典型分节丝状菌（SFB or Candidatus arthromitus，图3E）形态的细菌，挑选后测序也鉴定为SFB。

为观察细菌细胞生长状态，多色荧光探针染色是必要的。生物样品的荧光成像，一般要求添加防淬灭剂进行封片处理，并配合高NA的油镜，以达到清晰成像。而在本研究中，由于后续分选实验不能进行封片操作，也无法使用油镜，因此对成像设备的性能要求更高。且多色荧光探针标记肠道微生物的方法在过去仅止步于通过荧光成像确定生长模式。