免疫酶组织化学技术的常用酶及其底物
- 上传人: 研域(上海)化学试剂有限公司 |大小:10.5KB|浏览:3349次|时间:2018-09-14
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免疫酶组织化学技术的常用酶及其底物(一)辣根过氧化物酶在免疫酶技术中,辣根过氧化物酶(HRP)是Z理想、应用Z多的标记酶,是从一种称为辣根的植物根部分离、纯化获得。HRP分子中含有含铁血红素基团(高铁血红素),是HRP的活性基团,在溶液中呈棕黄色,HRP中的高铁血红素与H202形成一种复合物,然后脱水,氧原子形成。几种底物可使HRP氧化,Z常用的有二种,即多酚和硝基盐。HRP的优点有以下几个方面。(1)体积小(分子质量40kDa),不会遮盖抗原的结合部位,且穿透力强,易与细胞内抗原结合。(2)稳定且易获得高纯度酶制品。(3)具有较高活性及特异性。(4)不溶性好,终产物不向周边扩散。(5)组织中内源性酶较少,YZ方法较多。(6)价格相对较便宜。(7)特异性底物是过氧化氢(H202),可选用不同电子供体(发色基团),使终产物呈不同颜色。例如3,3’二氨基联苯胺(DAB)为棕褐色,3氨基9乙基卡巴唑(AEC)为红色,4氯1苯酚(CN)为蓝色。AEC室温下较稳定,产物不溶于水,但溶于有机溶剂,所以不能进行脱水等处理;又因其需用水溶性封固剂,时间长易褪色,限制了其应用。DAB是广泛应用的电子供体,产物既不溶于水,又不溶于有机溶液,可长期保存。其终产物具有嗜锇性,经锇酸处理后电子密度增加,适用于电镜下观察。但DAB的缺点是具有潜在的致癌性,所以应尽量减少吸人和接触次数,并严格管理废液。尽管有人反对应用DAB,但目前还未找到一种比它更好的替代品,所以应用依然Z为广泛。HRP与底物H202呈色反应原理见图4l。HRP的特异底物为H202,在分解Hz02过程中,与H202形成初级复合物,无电子供体时,反应不再继续进行,当电子供体存在时,反应以一定的速度形成第二种复合物。HRP催化H202已形成的中间型产物,迅速生成水,酶被还原,电子供体被氧化、聚合,再经氧化环化?Z后形成吲哚胺多聚体,此多聚体进一步氧化、环化,形成苯乙肼聚合体,如供氢体是DAB,产物为棕褐色;如是AEC,产物为红色。(二)碱性磷酸酶目前商品化的AKP均来源于牛小肠,称为牛肠碱性磷酸酶(calfintestinalkalinephosphatase),其分子质量为100kDa,故而穿透细胞组织的能力较弱。某些组织细胞内含有较高的内源性碱性和酸性磷酸酶,例如人体和鼠类、狗等动物组织的肝、肾、肠,对IHC染色会产生一定的干扰,因此限制了它的应用。AKP主要用于血涂片或涂片的白细胞抗原检测。但是由于AKP的呈色反应的敏感性要比HRP高23倍,显色时间可从30min到48h,可与HRP组合进行IHC的双重或多重标记。另外,内源性碱性磷酸酶可以在底物缓冲液中加入左旋咪唑(1evamisole)和镁离子(氯化镁),或提高底物缓冲液的pH值,可以有效地消除内源性碱性磷酸酶,使该酶应用比例日趋增多。目前该酶已广泛应用于原位杂交检测的显色和双重酶标染色。(三)葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(glucoseoxdase,GOD)以葡萄糖为底物,生成蓝色不溶性沉淀。该终产物较稳定,不溶于有机溶剂,故易保存,但因其分子质量为150kDa,不能穿人细胞,影响了其应用。另外,该酶的敏感性较低,主要是酶与底物反应敏感性低。目前主要用于IHC的多重标记。免疫酶组织化学技术的常用酶及其底物
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