EZ Trans细胞转染液-说明书

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订购信息产品名称货号规格保存价格(元)EZTrans细胞转染液C4058L10801mL4℃200EZTrans细胞转染液C4058L108250mL4℃1800EZTrans细胞转染液C4058L1084500mL4℃3500产品描述：细胞转染液（核心成分为线性聚乙烯亚胺，也称作LPEI），是新一代的转染试剂，带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过胞吞作用进入细胞。除了具有阳离子脂质体（如：Lipo2000,3000）的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点。EZTrans是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”体。其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。使用方法：瞬时转染方法1.接种细胞：转染前一天，用胶原酶消化细胞并计数（不建议用胰酶）。调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到70~80%。2.准备DNA-PEI复合物：DNA、EZTrans试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。依据下表所示，用Opti-MEMITM（Invitrogen）或其他适合的无蛋白培养基稀释适量DNA。用同样的培养基稀释EZTrans试剂。每1μgDNA需用2-5μLEZTrans转染试剂。一边轻轻涡旋装有DNA溶液的试管，一边将稀释的EZTrans转染试剂滴加至试管中（注意：请勿颠倒添加顺序）。充分混匀后，室温静置10~25min以形成DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时，请用圆底聚丙烯管，例如Falcon5mL/14mL离心管。3.转染细胞：直接向每个孔中加入DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时，去除生长培养基，替换成无血清培养基，然后滴DNA-PEI复合物。转染3h后，添加1/2体积的包含30%血清的生长培养基。4.孵育细胞和分析结果：在CO2培养箱中37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后Z快7h即可检测到转入基因的表达。请自行确定Z适合检测时间。?稳定转染方法1.接种细胞：转染前一天，用胰酶消化细胞并计数。调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，总体积如表1所示，每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到70~80%。2.准备DNA-PEI复合物：DNA、PEI试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。依据表1所示，用Opti-MEMITM（Invitrogen）或其他适合的无蛋白培养基稀释适量DNA。用同样的培养基稀释PEI试剂。每1μgDNA需用2-5μLEZTrans转染试剂。一边轻轻涡旋装有DNA溶液的试管，一边将稀释的EZTrans转染试剂滴加至试管中（注意：请勿颠倒添加顺序）。充分混匀后，室温静置10~25min以形成DNA-PEI复合物。当溶液体积较大时，请用圆底聚丙烯管，例如Falcon5mL/14mL离心管。3.转染细胞：直接向每个孔中加入DNA-PEI复合物并轻轻涡旋培养板/培养皿。在无血清条件下转染时，去除生长培养基，替换成无血清培养基，然后滴DNA-PEI复合物。转染3h后，添加体积的包含30%血清的生长培养基。4.孵育细胞和分析结果：在CO2培养箱中37℃下孵育细胞至可以分析检测。转染后Z快7h即可检测到转入基因的表达。5.转染24h后，将细胞传代至新鲜的生长培养基中（将细胞稀释10倍以上），在CO2培养箱中37℃孵育隔天。第二天加入与转染抗性基因相匹配的筛选药物。约1~2周可筛选到耐药性克隆，在这期间需经常更换含筛选药物的生长培养基。运输与保存方法：常温运输，4℃保存，保质期12个月。使用注意事项:质粒质量：请务必使用高质量转染级无内毒素质粒。通过260nm光吸收测定DNA浓度，260nm/280nm比值确定DNA纯度（比值应该在1.8~2.0的范围之内）。如有可能，请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。细胞条件：使用适当保存和经常传代的健康细胞。确保培养基没有被细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。建议使用GIBCO或者李记生物的胎牛血清培养细胞。?特别提醒:1.对于某些类型的细胞如HEK-293、HEK293T、NIH/3T3和COS细胞，在转染前两天铺板可显著提高转入基因的表达水平。如果选择转染前两天铺板，可适当降低铺板密度，以确保转染时细胞的汇合度仍为70~80%。2.对于接触YZ敏感的细胞，可适当降低铺板密度。3.即使在有蛋白（如10%的血清）存在的情况下，DNA-PEI复合物仍能转染细胞，但是DNA-PEI复合物必须在无蛋白存在的条件下形成。4.对大多数细胞来而言，每1μgDNA使用3.0μLEndoFectinTM试剂都能获得较高转染效率。使用者也可尝试每1μgDNA使用1~4μL体积线性PEI转染试剂进行优化。附：几种细胞转染方法比较几种细胞转染方法（试剂）特点比较表转染方法原理主要应用特点阳离子聚合物（EZTrans）带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过胞吞作用进入细胞。稳定转染瞬时转染所有细胞除了具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点，是新一代的转染试剂。阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。(若DNA浓度过高，中和脂质体表面电核，而降低了与细胞的结合能力)稳定转染瞬时转染所有细胞使用方法简单，可携带大片段DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的KY反应，导致高水平的毒性，这在很大程度上限制了其应用DEAE-葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时转染相对简便、重复比磷酸钙好,但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS细胞系磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染染瞬转染不适用于原代细胞（所需的DNA浓度较高）,操作简便但重复性差,有些细胞不适用细胞建议用CSCL梯度离心，转染是拷贝数较多逆转录病毒(RNA)通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞，之后反转入酶启动合成DNA并随机整合到宿主基因组中稳定转染特定宿主细胞可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等,但携带基因不能太大（<8kb）,细胞需处分裂期,需考虑安全因素腺病毒(双链DNA)先和细胞表面的受体结合，继而在αv整合素介导下被细胞内吞瞬时转染特定宿主细胞可用于难转染的细胞,需考虑安全因素Biolistic颗粒传递法（基因枪粒子轰击法）将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达瞬时性转染稳定转染可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞显微注射法用显微操作将DNA直接注入靶细胞核稳定转染瞬时转染转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞电穿孔法高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入稳定转染瞬时转染所有细胞适用性广，除了质粒外，还可转染大的基因组（>65kb）但细胞致死率高，DNA和细胞用量大，需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件，拷贝数较少1-20
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