小鼠IL-10 免疫组化试剂盒说明书
- 上传人: 通蔚试剂(上海)有限公司 |大小:61.5KB|浏览:248次|时间:2018-11-04
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小鼠IL-10免疫组化试剂盒说明书该试剂盒以HRP标记的链霉亲和素复合物(HRPStreptavidinConjugate,HRP-SA)为基础,可用于检测细胞、组织内的特异性IL-10抗原。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。在所用的IL-10一抗与相应靶抗原结合后,用生物化二抗与一抗特异性结合,Z后加入HRP-SA,形成抗原特异一抗生物素化二抗HRP-SA复合物,显微镜下观察成像。小鼠IL-10免疫组化试剂盒所含试剂:试剂A通透液:0.1%Triton-X10010mL(选用)试剂B封闭缓冲液(封闭用)20mL试剂C(原装进口分装)已稀释的即用型IL-10一抗(2.5ml)试剂D(原装进口分装)生物素化羊抗兔IgG1支(浓度1.5mg/mL,稀释比为1:300~1:500)50μL+抗体稀释液20ml试剂EHRP-SA复合物1支(浓度1μM,稀释比1:50~1:200)100μL试剂FDAB显色液5ml用户自备试剂:1.10mMTBS(pH7.2~7.4)三羟基氨基甲烷1.21g氯化钠7.6g加蒸馏水800mL,浓盐酸调pH值至7.2~7.4,Z后定容至1000mLTBS-T:TBS+Tween20(0.05%体积比)2.抗原修复液(依检测抗原不同而选择不同的修复液)10mMpH6.0柠檬酸缓冲液柠檬酸0.38g柠檬酸三钠2.45g加蒸馏水900mL,浓盐酸调pH值至6.0,Z后定容至1000mL或:0.5MEDTA修复液(pH8.0)EDTA2H2O186.1g柠檬酸三钠2.45g加蒸馏水700mL,用10mMNaOH调pH值至8.0,Z后定容至1000Ml3.缓冲甘油封固剂10mL4.Tween205mL石蜡包埋组织切片免疫染色实验步骤(建议方案):小鼠IL-10免疫组化试剂盒石蜡包埋组织切片3~4μm厚度1.烤片:将待做切片置于切片架上,于60℃恒温烤箱中至少烤1hr;2.脱蜡:切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10min;3.水化:切片经下行酒精水化,无水乙醇5min,95%乙醇2次(每次2min),85%乙醇2min;75%乙醇2min,自来水冲洗,ddH2O洗2×2min;4.抗原修复:根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复,常采用高压、微波(温度达到98~100℃)或酶消化修复法,室温自然冷却,自来水冲洗,ddH2O洗2×2min,TBS洗涤(2×2min)(具体修法见附1)*注:有些抗原勿需修复,直接进入第5步封闭。5.封闭:滴加试剂B,37℃湿盒孵育30min;6.加一抗:滴加用试剂C(即用型一抗),37℃湿盒孵育2hr或4℃7.洗涤:TBS-T洗涤(3×5min);8.封闭:滴加试剂B,37℃湿盒孵育10min;9.加二抗:滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗(试剂D),37℃湿盒中孵育30min;10.洗涤:TBS-T洗涤(3×5min);11.封闭:滴加试剂Tween20,37℃湿盒孵育封闭20min;12.加HRP-SA:滴加用试剂C稀释的试剂E(1:50~200,终浓度5~20nM),37℃湿盒中孵育30min;13.洗涤:TBS-T洗涤(3×5min),TBS洗涤(2×5min);14.显色:应用DAB溶液(试剂F)显色;15.复染:自来水充分冲洗,复染,脱水,透明;16.封片:待组织标本干后,用试剂缓冲甘油封固剂封片;17.观察成像:显微镜下观察成像。注意事项:1.修复后缓冲液须自然冷却,自来水冲洗后方能把切片取出,骤冷有可能导致结晶或抗原封闭。2.缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到,用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。3.若试剂为微量浓缩液,用前应低速离心,将内盖和管壁附着的溶液离到底部。4.封片前一定要换用TBS充分洗涤,以便洗去组织上残留的Tween20,否则会影响结果观察。5.如须复染细胞核,则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封片剂进行封片。附1:抗原修法常用抗原修复液:柠檬酸缓冲液(0.01MpH6.0)、EDTA抗原修复液(pH8.0或9.0)等等。一、酶消化修复法切片脱蜡水化处理,TBS冲洗,在组织上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育20~30min后TBS冲洗即可。二、微波抗原修复法微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档或继续微波10~15min,取出微波盒冷却至室温后,自来水冲洗,取出切片。因不同微波炉微波处理时间存在差异,须自行调整。三、小鼠IL-10免疫组化试剂盒直接高压抗原修复法取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾,将组织切片置于耐高温切片架上,修复液沸腾后放入切片架,盖上锅盖,待喷气后计时1.5~2.5min即可脱离热源,自然冷却至室温后自来水冲洗,取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。四、隔水式高压抗原修复法不锈钢高压锅中加自来水加热至沸腾,微波盒中加入修复液于微波炉中加热至沸腾,将切片放入微波盒中,再将微波盒放入高压锅中盖上锅盖,待喷气后计时4~8min即可关闭热源,自然冷却至室温后自来水冲洗,取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。
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