线粒体呼吸链复合物II活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)
- 上传人: 上海铭博生物科技有限公司 |大小:33.5KB|浏览:349次|时间:2018-11-08
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线粒体呼吸链复合物II活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)主要用途线粒体呼吸链复合物II(琥珀酸-辅酶Q还原酶)活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物二氯酚靛酚,通过反应系统测定样品中二氯酚靛酚还原后吸光峰值的变化,即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品(动物、人体、酵母)以及细胞或组织裂解悬液样品的琥珀酸-辅酶Q还原酶的特异性活性检测。可用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。技术背景线粒体呼吸链复合物II,通常称为琥珀酸-辅酶Q还原酶或琥珀酸脱氢酶(Succinate-CoenzymeQReductase;SuccinateDehydrogenase),是线粒体电子传递链与三羧酸循环链接的载体:含有四个亚单位,包括共价结合的辅基黄素腺嘌呤二核苷酸(flavinadeninedinucleotide;FAD)和三个铁硫ZX(Fe-Sclusters),以及细胞色素b亚单位,其Z特征性的酶活性是丙二酸钠敏感的琥珀酸-辅酶Q还原酶。复合物II催化琥珀酸(succinate)被氧化为富马酸(fumarate),线粒体内电子由供体FAD传递到内膜上辅酶Q受体(泛醌;ubiquinone)的能量转移反应,进行呼吸链传递。该酶异常会导致嗜铬细胞瘤(paraganglioma)、肾上腺嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)和Leigh综合征。基于琥珀酸底物,通过琥珀酸-辅酶Q还原酶的催化,氧化为富马酸,同时氧化型二氯酚靛酚(dichlorophenal-indophenol;DCPIP)转化为还原型二氯酚靛酚(dichlorophenal-indophenol;DCPIPH2),在分光光度仪下产生吸光峰值的变化(600nm波长),由此定量测定琥珀酸-辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是:ComplexIISUCCINATE+DCPIP+CoQ→FUMARATE+DCPIPH2+CoQH2蓝色无色↑Abs600nm↓Abs600nm产品内容缓冲液(ReagentA)20毫升反应液(ReagentB)2.5毫升阴性液(ReagentC)2毫升底物液(ReagentD)500微升产品说明书1份保存方式保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融;反应液(ReagentB)和底物液(ReagentD),避免光照,有效保证6月用户自备比色皿:用于比色的容器分光光度仪:用于比色分析培养箱:用于孵育反应物实验步骤实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;缓冲液(ReagentA)室温预热;反应液(ReagentB)和底物液(ReagentD)注意避光。然后进行下列操作。测定准备准备好待测样品(例如纯化线粒体样品等),置于冰槽里设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为600nm,间隔60秒,读数6次(共5分钟),并置零背景对照测定移取780微升缓冲液(ReagentA)到新的比色皿加入100微升反应液(ReagentB)加入20微升底物液(ReagentD)上下倾倒数次,混匀放进30℃培养箱里静置3分钟加入100微升阴性液(ReagentC)上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)即刻放入分光光度仪检测,此为背景空对照:600波长读数0分钟-600波长读数1分钟或5分钟样品活性测定移取780微升缓冲液(ReagentA)到新的比色皿加入100微升反应液(ReagentB)加入20微升底物液(ReagentD)上下倾倒数次,混匀放进30℃培养箱里静置3分钟加入100微升待测样品(注意:10微克总线粒体蛋白)上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)即刻放入分光光度仪检测,此为样品活性读数:600波长读数0分钟-600波长读数1分钟或5分钟计算样品活性【(样品读数-背景读数)X1(体系容量;毫升)X样品稀释倍数】÷【0.1(样品容量;毫升)X21.8(毫摩尔吸光系数X1或5(反应时间;分钟)】=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克单位=微摩尔二氯酚靛酚/分钟
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