细菌ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法试剂盒说明书
- 上传人: 上海铭博生物科技有限公司 |大小:73.62KB|浏览:1612次|时间:1970-01-01
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细菌ATP/ADP/AMP含量GX液相色谱法(HPLC)定量检测试剂盒产品说明书(中文版)主要用途细菌ATP/ADP/AMP含量GX液相色谱法(HPLC)定量检测试剂是一种旨在通过高氯酸酸性处理,碱性中和后,在GX液相色谱仪和紫外光度仪下(254nm波长)检测分析,分离出ATP、ADP或AMP波峰,以定量测定样品中腺嘌呤核苷酸含量的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细菌样品中ATP、ADP、AMP的含量检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。技术背景腺嘌呤核苷酸(adeninenucleotides),简称腺苷,包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷,是一种单体单位,为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的组成成分,并提供化学能量,在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能,调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低,且不稳定,通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况,来评价细胞的代谢情况和能量状态。单磷酸腺苷(Adenosinemonophosphate;AMP),又称为5'-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸(5'-adenylicacid),是一种在(脱氧)核糖核酸中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯,并由磷酸基团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。分子式为C10H14N5O7P,分子量347。AMP可以通过腺苷酸激酶(adenylatekinase)催化2分子ADP生成,或通过ATP以及ADP水解产生。AMP常以腺苷-3',5'-环化一磷酸(cAMP)形式存在于细胞中。AMP与ATP之比反映细胞ATP生成状况以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷(adenosinediphosphate;ADP),参与ADP-ATP循环,提供热能转换和动态平衡。三磷酸腺苷(Adenosinetriphosphate;ATP)存在于所有代谢活跃的细胞内,是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死,ATP浓度急遽下降。通过高氯酸酸性处理,排除蛋白质干扰,碱性中和后,在GX液相色谱仪和紫外光度仪下(254nm波长)检测分析,分离出ATP、ADP、AMP波峰,以定量其含量。产品内容酸性液(ReagentA)毫升中和液(ReagentB)毫升流相液A(ReagentC)毫升流相液B(ReagentD)毫升标准液(ReagentE)微升产品说明书1份保存方式保存标准液(ReagentE)在-20℃冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里;酸性液(ReagentA)和中和液(ReagentB)具有腐蚀性,注意操作安全;有效保证6月用户自备1.5毫升离心管:用于样品操作的容器4℃(微型)台式离心机:用于样品操作GX液相色谱仪(HPLC):用于定量测定实验步骤样品准备准备好待测细菌样品进行细菌计数:在分光光度仪上测定OD600或直接计数转移到预冷的1.5毫升离心管放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为10000g(或10000RPM,例如eppendorf5415)小心抽去上清液,保留沉淀颗粒加入XX微升预冷的酸性液(ReagentA)涡旋震荡1分钟转移到1.5毫升离心管放进4℃微型台式离心机再次离心10分钟,速度为6000g小心移取上清液到新的1.5毫升离心管加入XX微升中和液(ReagentB),充分混匀置于冰槽里静置30分钟即刻移入上清液到新的1.5毫升离心管(注意:避免移取沉淀颗粒)放进-70℃冰箱里保存或置于冰槽里待测二、测定准备开启仪器预热15分钟根据下表设置GX液相色谱仪(HPLC)参数参数推荐补充说明色谱柱长度:25cm直径:4.6mmWaters仪器或Agilent仪器固定相ODS流动相流相液A(ReagentC)和流相液B(ReagentD)参见运行程序流速1.3毫升/分钟注射容量50微升10微升至100微升检测紫外波长254nm柱温25℃出峰时间(retention)5.6分钟(ATP);6.5分钟(ADP);10分钟(AMP)参考运行时间15分钟参考运行程序运行时段程序时间开机后预运行XX流相液A(ReagentC)总10分钟检测运行时段XX流相液A(ReagentC)XX流相液B(ReagentD)0至9分钟XX流相液A(ReagentC)至XX流相液A(ReagentC)XX流相液B(ReagentD)至XX流相液B(ReagentD)9至15分钟关机前运行XX流相液A(ReagentC)XX流相液B(ReagentD)总10分钟标准样品配制准备好5个1.5毫升离心管,标记为1至5号管分别加入XX微升流相液A(ReagentC)到1至5号管移取XX微升标准液(ReagentE)到1号管,混匀小心移取XX微升1号管稀释的标准液(ReagentE)到2号管,混匀小心移取XX微升2号管稀释的标准液(ReagentE)到3号管,混匀小心移取XX微升3号管稀释的标准液(ReagentE)到4号管,混匀将1至5号管放进冰槽里备用,避免光照;标准管浓度见下表管号流相液A(ReagentC)标准液(ReagentE)标准ATP/ADP/AMP浓度1XX微升XX微升XX微摩尔/升2XX微升XX微升1号管XX微摩尔/升3XX微升XX微升2号管XX微摩尔/升4XX微升XX微升3号管XX微摩尔/升5XX微升00四、色谱分析将上述配制的标准液(ReagentE)和待测样品放进冰槽里等待每次(每个样品)注射50微升按照检测运行程序每次(每个样品)运行15分钟获得色谱波峰图:波峰面积(peakarea)或峰值,保存记录注意事项本产品为25次操作,包括标准液操作时,须戴手套系统操作过程中,标准液测定只需1次试剂具有挥发性,注意密闭瓶盖或使用封口膜酸性液(ReagentA)和中和液(ReagentB)具有腐蚀性,注意操作安全建议使用流相液A(ReagentC)作为阴性对照或作为基准线色谱柱的异物残留、气泡产生、温度未达均衡等将导致异常波峰、时间偏移等用户可以使用已知浓度的标准液(ReagentE)作为内参标准加入到样品中,然后进行萃取,检测回收率(recovery)腺嘌呤核苷酸的出峰时间(retention)以用户操作时,使用的标准液(ReagentE)实际出峰为准用户可以根据要求,计算实际浓度为:纳摩尔/毫升、纳摩尔/毫克蛋白等如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度腺嘌呤核苷酸HPLC的参考图谱如下:
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