利用微流控系统和实时图像处理实现单细胞的弹性自动测量

提升实验效率，加速科学发现

细胞的力学特性与其生理状态和功能密切相关。由于传统细胞弹性测量技术的限制，如低通量、细胞侵入性和高成本，微流控系统正在成为高通量细胞力学特性研究的强大工具。本文介绍了一种实时自动测量单细胞弹性模量的微流控系统。该系统集成了具有细胞收缩微通道的微流控芯片、压力泵、精密差压传感器和在线分析细胞变形的程序。该程序使用快速U-net分割细胞图像，测量细胞变形过程中的突出长度。随后，根据变形和所需压力，使用幂律流变模型实时确定细胞弹性。最后，BMSCs、Huh-7细胞、EMSCs和K562细胞的杨氏模量分别为25.13±15.19 Pa、69.74±92.01 Pa、54.50±59.31 Pa和58.43±27.27 Pa。微流控系统在细胞力学性能的自动化评估方面具有显著的应用潜力。临床相关性-本文的技术可用于细胞(如干细胞和癌细胞)的刚度自动化和高通量研究，其刚度数据可能有助于干细胞治疗和癌症研究。

细胞是生命的基本组成部分，其力学特性与其生理状态和功能密切相关，包括活性、类型、分化和凋亡。此外，细胞弹性揭示了细胞的病理变化，使其成为疾病诊断的可能生物物理标志。例如，转移性癌细胞的细胞刚度比正常细胞低70%以上。因此，深入了解细胞弹性可能有助于早期癌症检测。

当细胞通过光、电和磁场被拉伸、压缩或剪切时，它们会发生形态学变化。因此，原子力显微镜、微量注射器抽吸和磁性扭曲已被用于测量单个细胞的刚度。它们对该领域做出了很大贡献，但仍存在低通量、高成本和可能对细胞产生侵袭性影响等局限性。

随着微流学的发展，微流技术，如接触收缩通道、剪切流或延伸流，已被广泛用于测量和研究单细胞的力学特性。例如，Hou等人开发了一种具有收缩通道的微流控设备，并成功地根据其机械性能区分了MCF-10A细胞和MCF-7细胞。此外，还开发了一种并行微通道阵列，以基于幂律流变模型的高通量方式测量K562细胞和MDA-MB-231细胞的机械性能。

压力诱导细胞变形对使用数学模型(如牛顿液滴模型、线性弹性模型和幂律流变模型)进行细胞弹性计算具有至关重要的影响。因此，在微流控芯片中产生精确的压降非常重要。一种方法是使用注射泵改变体积流量，这使得通过在被困细胞上施加压差进行移液来测量弹性模量成为可能。另一种方法是使用精确设计的微结构来诱导流经特定位置的细胞变形。通过微结构诱导细胞变形的压力可以被间接模拟或评估。虽然这些技术极大地推进了细胞刚度研究的发展，但压力可能受到不可忽视的误差。因此，我们的团队构建了一个具有实时压力反馈的微流体装置，使他们能够准确地量化压力和细胞的突出，以进一步确定狭窄通道中变形的大型细胞的弹性。然而，人工测量细胞变形大大降低了产量和广泛应用的可行性。

近年来，机器学习在生物医学领域的应用已成为提高准确性和吞吐量的重要趋势。利用深度神经网络测量细胞变形程度，可以获得细胞在不同时间点的面积、周长和纵横比等形态参数的变化，从而量化细胞变形，显著提高了处理吞吐量，但由于细胞与微通道之间没有明显的边界，难以应用于本文的细胞挤压情况。此外，U-net在细胞计数、检测和形态测量的应用中也取得了成功。为了准确提取细胞轮廓并自动量化单细胞弹性，本文提出了一种实时系统，该系统由具有收缩通道的微流控芯片、实时压力反馈装置和在线分析程序组成。该系统基于幂律流变模型，使用U-net算法评估细胞在挤压过程中的变形。然后将程序和压力传感器结合起来，精确计算流过收缩通道的细胞的弹性。使用不同类型的细胞验证了该装置的能力。该系统在单细胞弹性测量方面具有相当大的潜力，为细胞变形研究提供了新视角。

图1 用于细胞弹性自动测量的微流体系统。A. 用于单个细胞弹性测量的微流体系统。它由一个压力泵、一个微流体芯片、一个DPS和一个实时处理程序组成。B. 使用包含1000个细胞图像的数据集进行模型训练。

单细胞弹性模量测量系统由微流控芯片、DPS、精密压力泵(Elveflow, OB1 MK3+， Paris, France)和实时测量程序组成。细胞实验前，微通道需要以10 μL/min的流速用75%酒精清洗15分钟。然后以相同的速率注入去离子水15分钟。

DPS安装在Honeywell传感器评估套件(New Jersey, USA)上，微控制器板(Arduino Uno Rev3)连接到计算机上。然后传感器的进口和出口连接到收缩通道两端的通道上。为了获得准确的压力，应避免气泡。然后以5 Hz的采样频率读取压力数据。

在注射到芯片之前，粘附细胞以悬浮液的形式重新悬浮在培养基中。首先，使用移液器从培养瓶中取出培养基。用PBS溶液清洗细胞，以去除任何残留的培养基，以避免对后续胰蛋白酶化的影响。然后，在培养瓶中加入2 mL胰蛋白酶溶液，放入孵育箱中孵育3-4 min。消化后，细胞悬浮液呈球形，加入8 mL培养基停止消化。将溶液以1000 rpm离心3 min后，弃去上清液，将细胞颗粒重悬于10 mL无胎牛血清培养基中，形成50万个细胞/mL的浓度。

测量骨髓间充质干细胞(BMSCs)、人肝癌细胞系(Huh-7细胞)、外胚层间充质干细胞(EMSCs)和人永生化髓系白血病细胞系(K562细胞)的弹性模量。首先将细胞悬液加入储液器中，并用21G针头和硅胶管(内径=0.6 mm，外径=1.0 mm)连接到芯片的入口。通过泵精确调节正压将细胞悬液注入芯片。细胞通过细小的收缩通道流向废液储液器。然后使用自制程序处理来自CCD摄像机的图像，并从DPS读取压力变化。连接到收缩通道两端的侧通道。每个单元的弹性在程序的界面上实时显示。

图2.不同类型细胞的弹性测量。A.细胞挤入收缩通道的显微照片(左)和分割结果(右)。B.随着时间的推移，细胞的突出程度不同。C.BMSCs,Huh-7细胞，EMSCs和K562细胞的弹性分布。

为了验证该系统的可靠性和性能，对30个BMSCs、33个Huh-7细胞、68个EMSCs和86个K562细胞进行了弹性实验，细胞在通过宽度为6μm、高度为16μm的收缩通道时，会发生较大的变形，其变形过程主要包括快速变形、持续缓慢变形和细胞进入收缩通道后快速逃逸3个阶段。

参考文献：
Cai Y, Chen S, Xu D, et al. Automatic elasticity measurement of single cells using a microfluidic system with real-time image processing. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Annual International Conference. 2023 Jul;2023:1-4.

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