提升实验效率，加速科学发现

使用带有微流体通道的器件可以精确控制流过它们的液体。不混溶液体的合并流动可以在载体液体中产生具有高度单分散微滴的乳剂，这是小型化反应容器的理想选择，可以以每秒数万个微滴的高通量产生。控制这些液滴的大小和组成通常是通过控制泵送系统将液体推入装置来实现的;然而，这是一种间接的操作，如果在液滴的大小或组成上需要绝对的精度，这是不充分的。在这项工作中，我们扩展了先前基于图像的闭环反馈控制微滴生成的发展，不仅可以控制微滴的大小，还可以通过合并两个水流来控制微滴的组成。反馈可以直接控制所需的体积参数和两种成分在大范围内的比例，并且在体积和成分的单分散性方面优于当前的技术。这种技术对于精确控制液滴至关重要的情况是理想的，或者需要不同浓度但体积相同的液滴库。

微流控技术在受控环境中生成微小液滴，即所谓的微流控中的微滴，为开发用于化学和生化反应、库生成、筛选以及纳米粒子制备等众多应用的微尺度反应器提供了强大平台。最近的报告指出，在微观限制下，反应动力学会得到提高和加速，特别是在液滴、薄膜和乳液中。将两种互不相溶的相混合在微流控通道几何结构中是一个相对简单的过程，可以生成一种相分散在另一种相中的微滴。通道几何形状以及添加剂如表面活性剂和壁涂层可控制分散相和连续相类型，并且它们的流速可调节微滴生成大小和速度。这提供了足够多样性；然而，在需要更精确液滴大小或组成时，则需通过试错法确定正确参数来产生所需液滴，这往往耗费大量时间。在许多应用场景下，精确控制液滴体积至关重要；因为体积变化可能导致产品浓度估计误差产生, 例如当封装单个对象（如单个分子或细胞）甚至每个液滴封装约100个细胞时, 泊松统计就显得尤为重要。

注射泵在微流控研究中被广泛使用，因为它们提供了一种简单的方法，可以将给定的流速输入到微流控设备中。当电机转动时，根据需要增加压力以维持给定的平均流速，并保持该流速稳定，直至达到电机的极限力。这使得它们成为连续流动实验的理想工具，在这些实验中需要一组恒定的流速；然而对于像微滴实验这样的系统来说，绝对流速通常不是最有意义的参数。相比之下，滴体积、油滴体积比和滴生成频率等参数更直观且相关性更强，并且需要进行考虑和控制。这些参数并非实验直接输入值，而是由物理特性、通道几何形状和驱动流速之间复杂相互作用所决定。因此无法直接控制这些参数。然而基于图像反馈机制可通过测量所需参数并根据变化情况调整控制参数来实现对其进行调节。随着相机帧率提高、微秒级曝光时间及实时图像处理算法应用以及机器学习方法引入, 图像分析不仅能够用于测量, 还能够用于控制微滴和微流体各个方面, 这一应用近年来得到了迅速发展。

在这项研究中，基于图像的微滴测量技术被扩展到闭环反馈控制领域，以实现对两组分微滴的可控生成，用户可以定义微滴的物理体积和两种组分的相对浓度。

目前的技术仅限于从单一的水性进料流中生成超单分散微滴，这限制了该技术的潜在应用。通过将图像反馈扩展到双水系统，可以生成两种组分的微滴并控制它们之间的相对比例。在此基础上，利用基于图像的滴体积测量技术，可以对每个微滴的体积进行滴-滴测量，并通过分析光电探测器上微滴的散射光确定频率，从而计算出总的水流速率。如果在两个水性输入线中的一条中使用毛细管式流量计，则可以推断出另一条的流量。通过仅使用一个流量计，可以简化整个系统的结构，并具有许多优点，例如可以使两个组件中的一个具有更小的体积要求，最小化毛细管式流量计中的交叉污染问题、污垢或堵塞，特别是防止含有颗粒或细胞的样品受损。

将反馈技术应用于多组分液滴可以实现更复杂的情况下的超单分散生成，这对于在化学和生物化学分析中需要精确控制体积和浓度的情况非常有益，例如涉及单分子或单细胞研究的化学和生物化学分析，其中体积或稀释比的微小变化可能对结果产生很大影响。它还非常有益于生成具有不同组分但具有严格控制体积的液滴库，这对于需要以高通量方式分析具有广泛已知浓度范围的样品的筛选应用非常有益，例如在药理学或毒理学研究中。

输入流体由压力控制器(Elveflow 200mbar OB1, Elvesys, Paris, France)驱动，由运行National Instruments LabView 2021的PC控制。两种输入流体中的一种通过毛细管流量计(LG16-0150D, Sensirion AG, St?fa，瑞士)来监测该组分的流速。为了验证这一概念，第二种流体也通过了流量计;然而，测量的流量不用作反馈的一部分，而仅用于验证该技术。由于只需要一个流量计，该系统将允许使用珍贵的样品，而这些样品可能不适合通过流量计流动，这可能是由于扫描体积大，希望最大限度地减少污染，或者因为样品中含有颗粒或细胞，通过毛细管可能会损坏。

图1：(a)实验装置示意图，包括配备触发相机和液滴检测器(光电二极管)的显微镜，用于对流过微流体装置的液滴进行成像，以及由软件控制的空气-液体泵的流体泵送系统，以产生给定大小和成分的液滴。彩色箭头表示数据流，箭头表示指向目的地的数据源。(b)示例光电二极管电压轨迹显示5个液滴通过检测器区域。轨迹分析提供了反馈计算中液滴产生的频率。(c)液滴生成结的显微照片，显示两种水组分相遇(PBS-top;台盼蓝(染料底)前的微滴生成。比例尺为100μm。

图2：液滴体积测量和流量计算的验证。(a)基于液滴体积和频率测量的估计流量与在一定流量范围内的单个水入口实验的实测流量的比较。粗线表示用于反馈回路的测量;细线表示测量的流量，颜色表示不同的驱动泵送速率。(b) (a)的数据显示估计流量与测量流量的对比。误差条是流量的标准偏差。液滴产生速率为~ 100hz。(c)双水实验中流量测量的验证。该图显示了反馈回路中使用的参数与使用附加验证流量计获得的值的比较。这两种测量结果非常吻合。插图显示了在实验的不同阶段含有台盼蓝染料和PBS混合物的液滴。虚线表示期望浓度改变时的目标流速。比例尺对应50μm。

图3：(a)使用开发的系统(深蓝色，深红色)和使用标准注射泵(浅蓝色，浅红色)时获得的液滴体积(上，蓝色)和成分(下，红色)的比较。散点图显示单个液滴随时间的测量值，而右边的直方图显示归一化分布。使用基于图像的反馈方法，在体积和构图方面都可以看到显著的改进。(b)对于由~50%台盼蓝染料和50% PBS组成的液滴，将注射泵(左)与基于图像的反馈(右)相比，液滴中线随时间的变化曲线。(c)液滴的对比增强图像显示注射泵的最高和最低测量液滴浓度之间的测量强度变化(上)和基于图像的反馈(下)。(c)中的所有图像都采用相同的调整水平和查找表进行处理。比例尺对应50μm。

图4：(a)使用基于图像的反馈方法(上)和注射器泵(下)获得的目标浓度范围内测量的液滴浓度的直方图分布。插图显示了在给定浓度范围内具有浓度的液滴的累积分布。基于图像的反馈方法(实线)显示液滴分布有很大改善，99%的液滴在目标的2.8个百分点内，而注射泵在9.6个百分点内实现了99%的液滴。(b)当目标浓度在5%至95%范围内变化时，液滴体积(蓝色)和浓度(红色)的散点图(红色实线)表明，即使改变浓度，液滴体积也保持一致。液滴产生速率为~30 Hz。(c)改变液滴体积时(蓝色)得到的(b)液滴体积直方图，以及在恒定靶浓度下(紫色)得到的显示一致体积分布的可比数据。

图5：(a)用流量计得到的测量液滴浓度的散点热图与从液滴图像得到的灰度值进行比较，显示了两种测量结果之间的强相关性。插图显示了所有液滴与平均值的综合偏差。(b)短时间内的浓度测量，显示了每个液滴的灰度测量(方点)与反馈过程中使用的测量(实线)在一系列浓度之间的相关性。(c)反馈(橙色)和灰度测量(绿色)中用于计算的浓度偏差的直方图，以及由50%台普兰蓝和片外制备的PBS的单进液产生的液滴组成的对照样品(紫色)。请注意，紫色的控制直方图被裁剪为清晰。比例尺对应50μm。


参考文献：
Cantwell, Christy, John S. McGrath, Clive A. Smith, and Graeme Whyte. 2024. "Image-Based Feedback of Multi-Component Microdroplets for Ultra-Monodispersed Library Preparation" Micromachines 15, no. 1: 27. https://doi.org/10.3390/mi15010027

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