利用高内涵筛选分析系统进行心肌细胞增殖分析

1. 1 天、30 天龄 C57BL/6J 小鼠（维通利华）

2. 湿盒

3. 组化笔 (abcam, catalog number: ab2601)

4. 盖玻片 (世泰, catalog number: 10212450C)

5. 粘附载玻片 (世泰, catalog number: 188105)

6. 组织包埋盒 (世泰, catalog number: 31050102w)

7. PBS 缓冲液粉末 pH7.3 (中杉金桥, catalog number: ZLI-9062)

8. PBS 缓冲液 pH7.4 (gibco, catalog number: C10010500BT)

9. 4%多聚甲醛 (LEAGENE, catalog number: DF0135)

10. 50X EDTA 抗原修复液 (LEAGENE, catalog number: YB-23522-1)

11. DEPC 水 (LEAGENE, catalog number: NR0001)

12. Tween 20 (Biofroxx, catalog number: 1247ML500)

13. 山羊血清封闭液 (中杉金桥, catalog number: ZLI-9056)

14. Trito? x-100 破膜液 (Sigma-Aldrich, catalog number: X100)

15. 抗体稀释液 (中杉金桥, catalog number: ZLI-9030)

16. pH3 抗体 (Millipore, 种属反应性: 小鼠, 人, catalog number: 06-570)

17. α-actinin 抗体 (Abcam, 种属反应性: 小鼠,大鼠,人, catalog number: ab9465)

18. Alexa Fluor 488 羊抗兔免疫荧光抗体 (Invitrogen, catalog number: A21206)

19. Alexa Fluor 594 羊抗鼠免疫荧光抗体 (Invitrogen, catalog number: A21203)

1. 全自动组织脱水机 (Leica, catalog number: ASP300S)

2. 包埋机 (Leica, catalog number: EG1150H)

3. 石蜡切片机 (Leica, catalog number: RM2235)

4. 展片机 (Leica, catalog number: HI1210)

5. 烤片机 (Leica, catalog number: HI1220)

6. 全自动染色机、封片机 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: ClearVue+Gemini)

7. 超纯水设备 (Thermo Fisher Scientific, catalog number: 50136146)

8. 电磁搅拌器 (IKA, catalog number: MS100)

9. 脱色摇床 (海门麒麟医用仪器厂, catalog number: TS-2)

10. 涡旋振荡器 (Scientific Industries, catalog number: SI-0256)

11. 台式高速冷冻离心机 (Eppendorf, catalog number: 5804R)

12. 移液器 (Eppendorf)

13. 普通 4 °C 冰箱

14. 共聚焦显微镜 (Zeiss, catalog number: LSM 800)

15. 高内涵筛选分析系统 (Molecular Devices, catalog number: ImageXpress Micro)

1. ZEN

2. MetaXpress

1. 1 天、30 天龄的 C57BL/6J 小鼠购买自北京维通利华公司；

2. 1 天龄小鼠置于冰上麻醉 2min，30 天龄小鼠按照 0.2ml/20g 注射浓度为 17.5 μg/ml 的三溴乙醇溶液进行麻醉。剪刀剪开小鼠胸腔部分皮肤和皮下组织肌肉层，镊子撑开胸腔，迅速剪下心脏和流出道置于预冷的 PBS 缓冲液中，剪掉血管连带的多余组织，排出心脏中的血液；

3. 4% 多聚甲醛中固定心脏组织。1 天龄小鼠心脏组织固定 24h，30 天龄小鼠心脏组织固定 48 h。固定结束后将心脏组织置于包埋盒中在流动水下冲水，去除心脏组织中的多聚甲醛液体；

4. 依据心脏组织大小使用全自动脱水机的不同程序进行脱水，样本依次置于 75%、85%、95% 和无水乙醇中，随后在二甲苯中透明，最后置于 60 °C 液态石蜡浸泡；

5. 使用石蜡包埋机将心脏组织按照胸腔中心脏位置摆放，利用石蜡将心脏组织固定于包埋盒中；

6. 蜡块置于冰冻机冷冻 1 小时，展片机预热温度至 45 °C，使用 Leica 石蜡切片机切至心脏最大面，使得心脏腔室完全暴露(图 1)，随后按照 5 μm 厚度进行切割，使得组织切片完全粘附于载玻片，待用。

1. 组织粘附的载玻片置于烤片机上 68 °C 烘烤 45min，防止脱片；

2. 载玻片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各 10min，乙醇浓度为 100%、95%、80%、75%、50% 中水化 5min，蒸馏水洗 5min；

3. 提前配制 1× EDTA 抗原修复液(pH=9.0)于高压锅内煮沸，将心脏组织切片放入高压锅中，使得修复液完全覆盖组织切片，高温修复 2min，流动水下冲洗冷却 20min；

4. PBST 缓冲液冲洗 5min，2 次；PBS 缓冲液冲洗 5min，3 次；

5. 配制 0.3% 封闭通透液滴加在心脏组织切片上，室温孵育 1 h；

6. 抗体稀释液稀释 pH3 一抗与 α-actinin 一抗滴加到切片组织表面，4 °C 过夜；

7. 一抗孵育 16 h 后，室温复温 1 h；

8. PBST 缓冲液冲洗 5 min，2 次；PBS 缓冲液冲洗 5 min，3 次；

9. 按照 1:400 比例使用 PBS 稀释 Alexa Fluor 594 羊抗小鼠、Alexa Fluor 488 羊抗兔免疫荧光二抗，适量滴加于心脏组织切片上，室温避光孵育 1h；

10. PBST 缓冲液冲洗 5min，2 次；PBS 缓冲液冲洗 5min，3 次；

11. 含 DAPI 的封片剂进行封片，注意封片时不能有气泡产生。

使用荧光共聚焦显微镜进行成像(图 2)；

采用 High Content Image Processing Software 进行图像采集(图 3)，流程如下：

1. 使用无水乙醇将玻片擦拭干净，晾干后置于高内涵筛选分析系统中进行图像采集与分析；

2. 打开 MetaXpress5.1 软件，选择 10 倍物镜，根据采集对象选择单个玻片采集；

3. 每个心脏组织框选 18 × 18 个视野，我们选择 DAPI、FITC、Texas Red 三个荧光通道，选取一个视野调整荧光通道参数。

4. 动态拍照状态下选择采集区域；

5. 采集图像。

详情请见下方视频。

选择采集的图像荧光信号(图 3)，选择一个视野分别对三个荧光通道进行参数调整，首先调整“All nuclei”荧光强度圈选出 DAPI 标记的细胞核，其次根据“GFP”荧光强度圈出 pH3⁺表达位点，最后根据“Texas Red”圈出 α-actinin 标记的心肌细胞(图 4)，统计细胞核中表达 pH3 的心肌细胞数量即为增殖的心肌细胞数量(图 5)。

详情请见下方视频。

1. HE 染色展示石蜡切片机切至心脏最大面，心脏四腔室完全暴露(图 1)。

图 1.HE 染色展示心脏石蜡切片最大面

2. 使用共聚焦荧光显微镜对心脏组织切片进行成像，Z 轴扫描显示 pH3 与心肌细胞细胞核共定位(图 2)。

图 2.荧光共聚焦显微镜成像

哺乳动物出生后 1 周心肌细胞退出细胞周期(Alkass et al.,2015)，因此，在小鼠出生后 1 天心肌细胞增殖旺盛，pH3⁺ 细胞数量较多；而小鼠出生 30 天心肌细胞几乎不再增殖，pH3⁺ 心肌细胞无法被检测到。

3. 高内涵筛选分析系统分别采集心脏组织切片中 DAPI、FITC、Texas Red 荧光标记的图像流程及采集的荧光信号。按照图 3A 所示流程依次设置图像采集区域，分别将 DAPI 标记的细胞核、pH3 标记的增殖点、α-actinin 标记的心肌细胞荧光信号调至清晰焦面。

图 3. 高内涵筛选分析系统图像采集流程及采集荧光图像。

A.图像采集流程界面；B.DAPI 标记的细胞核；C.pH3 标记的增殖细胞；D. α-actinin 标记的心肌细胞；E. 三通道叠加。

4. 分析采集图像的荧光信号。

在图 4 中，选择一个图像视野，分别圈出 DAPI 标记细胞核、pH3 标记细胞增殖点、α-actinin 标记心肌细胞的荧光信号。如上图所示，A(左)为分析 DAPI 标记荧光信号的参数设置，A(中)为 DAPI 标记荧光信号的采集图像，A(右)为分析 DAPI 标记荧光信号的圈选区域；B(左)为分析 pH3 标记荧光信号的参数设置，B(中)为 pH3 标记荧光信号的采集图像，B(右)为分析 pH3 标记荧光信号的圈选区域；C(左)为分析 α-actinin 标记荧光信号的参数设置，C(中)为 α-actinin 标记荧光信号的采集图像，C(右)为分析 α-actinin 标记荧光信号的圈选区域。

4. 荧光信号图像数据分析设置。

A：DAPI 荧光信号数据分析；B. pH3 荧光信号

数据分析；C. α-actinin 荧光信号数据分析。

5. 所采集图像的荧光信号分析结束后，系统自动计算 pH3⁺ 心肌细胞数量所占比例，格式如下：

采集图像的荧光信号分析结束后，根据 DAPI、FITC、Texas Red 三通道定位情况，计算细胞核中表达 pH3 的心肌细胞数量，得出如图 5 所示的结果。“Subtotal Profile 1XX”表示 DAPI 染细胞核的数量为 1156，“Subtotal Profile 12X”表示 DAPI 与 pH3 共定位的细胞数为 18，“Subtotal Profile 1X3”表示细胞核完整的心肌细胞数量为 103，“Subtotal Profile 123”表示细胞核表达 pH3 的心肌细胞数为 9，则增殖的心肌细胞比例为表达 pH3 的心肌细胞数量与所有的心肌细胞数量之比。

图 5. 高内涵筛选分析系统分析数据结果格式

将 50× 的 EDTA 抗原修复液 20 ml 加入到 980 ml 超纯水中配制为 1× EDTA 抗原修复液待用；

将 3 μl Trito? x-100 破膜液加入到 1 ml 山羊血清封闭液中配制为 0.3% 封闭通透液；

将 23 g PBS 粉末加入到 2 L 超纯水中，搅拌至粉末全部溶解，液体澄清，为 PBS 缓冲液；将 2 ml Tween-20 加入到 PBS 缓冲液中，搅拌至澄清，为 PBST 缓冲液。

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