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解决方案
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利用高内涵 3D 成像及分析,肺类器官可作为体外毒性评价的分析模型
发布:美谷分子仪器(上海)有限公司浏览次数:1208摘要
类器官模型因其能够再现真实组织的复杂性而在生物研究和筛选中越来越受欢迎。为了模拟体内的人体肺器官,我们在有助于 3D 结构形成的条件下培养了原代人肺上皮细胞,重现了肺气道形态和功能上的特征。在肺类器官培养中,上皮干细胞和祖细胞在添加了一系列生长因子的 ECM 中培养。类器官随后生长成复杂的结构,保留了多系上皮细胞簇。这些特性使类器官培养成为一种富有前景的手段,可以广泛应用于基础和转化方法,如药物筛选和疾病建模。
这里我们阐述了一种高内涵成像方法,可以监测和可视化肺类器官的生长和分化,3D 结构的重建,类器官结构的复杂分析,细胞形态和活力,以及不同细胞标记物的表达。3D 肺类器官植入在 Matrigel domes。发育中的类器官包括具有复杂形态的球形物体,包括腔和膀胱结构。在 8 周的生长过程中,我们监测到了大小和复杂性的增加。用透射光监测类器官,然后用 20-30 层 Z 轴扫描透过基质凝胶对染色的类器官成像,物镜倍数为 10 – 40x。使用 ImageXpressConfocal HT.ai 智能化共聚焦高内涵成像分析系统新配置的激光光源显著的提高照明强度,从而显著提高了亮度、检测灵敏度和成像速度。
方法
细胞:3D 肺类器官
3D 肺类器官是由人体原代肺上皮细胞 (ScienCells, Co.)分离而来。按照 ScienCells 的方法,细胞在 2D 范围内增殖两 周。然后,根据 Stem Cell Technologies 公司生产的 PneumaCult ™ Airway Organoid Kit 的方案,用试剂将细胞在 90% 的 Matrigel (Corning) 中接种到Matrigel domes。细胞形成 3D 类器官,在培养的 2 周内每隔 2 天更换一次 PneumaCult Airway Organoid 培养基,然后再使用 PneumaCult Airway Organoid 分化培养基培养 6 周。使用不同的孔板类型培养类器官 ( 见结果部分 ),然后用化合物处理或各种标记物标记以评价形态学和活性。每周用 4 倍或 10 倍物镜在透射光下监测类器官的生长和发育。工作流程的示意图如下所示。类器官成像和 3D 分析
在染色缓冲液中加入染色试剂,并将其加入到一半的培养基中,通常对 3D 肺类器官染色 2 小时。移除染色试剂,用 PBS 冲洗 30 分钟,加入新鲜培养基。类器官样本可以进行活细胞成像,或用 4% 甲醛固定,保存在室温下用于以后成像。使用带有水镜的 ImageXpress Confocal HT.ai 系统对类器官样本成像。使用 4x 和 10x物镜下做共聚焦拍摄,20x 或 40x 图像用水镜和共聚焦拍摄,根据物镜覆盖范围 150-250 µm,每隔 3-10 µm 拍摄 Z-stack 图像。3D 图像分析在 MetaXpress 高内涵成像获取和分析软件中完成。
仪器图 1 用共聚焦拍摄监测类器官结构的复杂性。活的类器官被 Hoechst,MitoTracker 和 Calcein AM 染色。10x 或 20x,每隔 5-10 µm 做共聚焦成像。A. Z大的投影图片。B. 单个 Z 平面的共聚焦图像显示,可以观察和测量管腔、空腔和突起,与更成熟表型的外观一致。
结果
3D 肺类器官的培养与成像
从原代肺上皮细胞开始培养,然后使用 Stem CellTechnologies 公司 ( 见方法 ) 提供的试剂和方案在Matrigel domes 培养类器官。简单的说,细胞在 2D 中扩增,然后与添加生长因子基质胶 (Matrigel) 混匀并接种到 24 孔或其他类型孔板内的 Matrigel domes 中。
2D 扩增 → Matrigel dome 3D → 分化 → 实验
类器官的生长监测和 3D 图像分析
通过透射光成像或者 Hoechst 染色监测类器官的生长和发育。用共聚焦对 Matrigel 中的类器官做自动的活细胞成像,4x 或 10x 物镜。通过对单个 Z 平面或 3D 投影的图片分析可以确定类器官的大小和数量。在 6-8 周的培养中可以观察到大小随时间的变化。
图 2 A. 在 Matrigel dome 中培养了 4 个星期的类器官,透射光图像 (4x) 或 Hoechst 染色图像 (10x)。类器官的平均直径随着时间增长。B. 类器官大小的对比, Hoechst 染色两星期 ( 蓝色 ),Hoechst and MitoTracker Orange ( 红色 ) 染色的 6 星期样本。用共聚焦拍摄类器官,10 µm 间隔在 Z 轴方向拍摄 23 张图片。Z大的投影图片如上图显示。
图 3 利用 3D 分析模块做图像分析,重新定义类器官结构的复杂性。类器官 (A),使用 CME 模块 (Custom Module Editor) 可以识别,计数,定义细胞或亚细胞结构 (B)。分析会应用在每个 Z 平面,然后软件会结合这些信息做出 3D 空间上的检测结果。
结果
表型变化及化合物作用的检测
类器官为疾病模型和化合物药效评价提供了一个非常有效的工具。对类器官自动化的成像和分析对于定量评价类器官的表型变化以及提高实验和检测通量是非常重要的。
2D 投影图片的分析可以用于高通量实验中。例如下面的图片显示了对照组类器官与炎症细胞因子和毒性试剂处理的类器官做活-死细胞分析。
图 4 用 5 nM TNFα 处理类器官 3 天。用 Hoechst ( 蓝色,核染料 ) 和 EtHD ( 红色,死细胞染料 ) 染色类器官,10x 物镜成像,Z大的投影面。图像在 2D 水平下分析活细胞和死细胞数量。
共聚焦成像和 3D 图像分析对于获取 3D 生物学实验的复杂性非常有效。3D 类器官有中空表型,在内里有腔,更容易被光穿透,能够对嵌入基质中的多个显微组织成像。
一些抗肿瘤药物,如 ibrutinib,被用于治疗白血病,已被证明会引起肺毒性。我们用 3D 肺类器官测试了抗肿瘤药物 ibrutinib 的毒性。图 5 类器官在经过 6 个星期的发育后,被不同浓度的 ibrutinib 处理 72 h。然后用 EtHD-1 染色类器官用来检测死细 胞,使用 ImageXpress Confocal HT.ai system 拍摄。EtHD-1 阳性 ( 死细胞 ) 和阴性 ( 活细胞 ) 的数量通过 3D 分析计数并计算 EC50。
有趣的是,Ibrutinib 在 EC50 ~3 μM 时观察到显著的细胞毒性,而同样的细胞在 2D 培养条件下只有在 100 µM 浓度下才能观察到毒性作用。这一结果可能表明 3D 模型对选定药物的细胞毒性作用具有更高的敏感性,这就强调了使用更复杂的模型来评价化合物效应的重要性。
总结
使用 Stem Cell Technology 公司的方案可以成功的形成 和发育 3D 肺类器官。类器官在基质胶中的生长和发育可以通过自动成像获取,并用于评价类器官的大小,体积和复杂性。
共聚焦成像结合 3D 分析可以定量细胞特征,数量以及在类器官内不同表型的细胞 ( 细胞个数,活 - 死细胞评价,特殊标记物的细胞分类等等 )。该模型可以用于药品和其他化合物的毒性评价。
2022-04-29相关仪器 -
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