高效准备婴儿配方中氨基酸的分析

创制具有理想营养剖面的婴儿配方奶粉是至关重要的。对于用配方奶粉喂养的宝宝来说，婴儿配方奶粉通常是他们出生后六个月内的主要营养来源。婴儿配方奶粉的目标是尽可能接近母乳的成分。对于对母乳过敏的婴儿来说，配方奶粉尤为重要，因为它可能是他们唯一的营养来源，而且配方必须不含过敏原。

美国食品和药物管理局（FDA）规定了婴儿配方奶粉中 29 种不同营养素的最低含量，包括蛋白质、脂肪、碳水化合物以及维生素等微量营养素。其中一些营养素，如蛋白质，也有最高含量的限制。婴儿配方奶粉中的蛋白质含量高于母乳，这引起了关于其如何影响婴幼儿成长的研究仍在进行中，但这凸显了了解婴儿配方奶粉中蛋白质水平的重要性。

当检查结果时，我们发现 Discover Prep 得出的婴儿配方奶粉水解物的结果与传统方法测定的结果相似，且具有出色的重复性。Discover Prep 相比传统方法有几个优势，例如快速的压缩空气冷却和易用性，其介电微波加热机制提供了即时和均匀的体积加热，有助于加速水解过程，而不损害回收率或精确度。

试剂和样本

本研究中使用的所有试剂均购自知名的商业供应商。本研究采用了美国国家标准与技术研究院（NIST）的婴儿配方奶粉标准参考物质（SRM）。为了重组婴儿配方奶粉，将 1 克的婴儿配方奶粉与 9 毫升的水混合。水解溶液在使用前被新鲜制备，以确保最佳新鲜度和效果。

婴儿配方奶粉样本使用 CEM Discover Prep 系统进行水解。随后，通过柱前衍生化过程确定了水解物中的氨基酸含量，接着进行超高效液相色谱（UPLC）注射和在 260 nm 波长下的光电二极管阵列（PDA）检测。对于水解物的液相色谱-光电二极管阵列（LC-PDA）分析，使用了 Waters AccQ-Tag Ultra 衍生化试剂盒。使用 Discover Prep 样本制备得到的结果与传统烘箱方法以及相应的分析证书（CofA）中的信息进行了比较，以衡量准确性和效率。

Discover Prep 水解方法在利用 Discover Prep 进行的水解过程中，将 750 μL 的重组婴儿配方奶粉样本转移到一个 35-mL 的 Pyrex 玻璃瓶中，然后安装搅拌棒。记录样品的精确质量以供后续分析。接下来，向每个微波反应瓶中加入 5 mL 含有 1% 苯酚的 6 N 盐酸（HCl）。为了最小化氧化，瓶子被氮气（N₂）冲洗 60 秒，之后迅速用 Teflon 衬里的硅胶盖密封，并放置在样品架上，随后放入 Discover Prep 的腔体中。为了确保可靠性和准确性，样品进行了三次重复分析。为婴儿配方奶粉的氨基酸水解专门配置了一步到位的动态方法。精心编程到 Discover Prep 中的该方法参数包括：

酸性水解

瓶型：Pyrex

控制类型：动态

温度：160 °C

时间：20分钟

压力：300 PSI

功率：300 W

搅拌：高

样品制备和衍生化分析

所有水解后的溶液都使用 0.2 μm PTFE 过滤器仔细过滤，以去除任何颗粒物质。然后，通过用 6 M NaOH 中和溶液来调整 pH 值，为衍生化作准备。根据 Waters AccQ-Tag Ultra 衍生化试剂盒的协议，将 80 μL 的硼酸缓冲液加入指定的回收瓶中。接着加入 10 μL 的水解物样品。然后密封瓶子，并使用涡旋混合器彻底混合内容物以确保均匀性。下一步是将 10 μL 预先准备好的衍生化试剂从试剂盒加入到每个样品反应瓶中。在加入衍生化试剂后，再次将混合物涡旋 10 秒钟以确保完全反应。最后，将样品在 55 °C 下加热 10 分钟以促进衍生化过程，然后进行解析测定。

分析

每个衍生反应的 1 μL 样本被精确地注射到 Waters AccQ-Tag Ultra C18 柱（1.7 μm, 2.1 x 100 mm）上，该柱与装备了 Waters PDA 检测器的 Waters ACQUITY H-Class? UPLC 系统相连。色谱分析在控制的流速 0.4 mL/min 下进行。通过将柱温保持在 55 °C 来实现最佳分离，并在 260 nm 波长下仔细监测吸光度。为高效分离而量身定制的洗脱梯度详见表1。使用的流动相是A：在 MilliQ 水中稀释了 10 倍的 Waters AccQ-Tag 洗脱液A和B：Waters AccQ-Tag 洗脱液 B。为了为每种氨基酸建立校准曲线，使用浓度为1、5、10、25、50、100 和 200 pmol/μL 的 Waters 氨基酸标准（Waters 公司，零件号 WAT088122）进行衍生化。线性回归用作样品定量评估的分析工具。

表1. 用于衍生化氨基酸分离的梯度

图1. Discover Prep 数据与传统氨基酸水解和 SRM 分析证书（CofA）的比较

1.Food and Drug Administration. The Office of the Federal Register (OFR) of the National Archives and Records Administration (NARA), and the U.S. Government Publishing Office (GPO). 21 CFR 107. Infant Formula: The Addition of Minimum and Maximum Levels of Selenium to Infant Formula and Related Labeling Requirements.https://www.federalregister.gov/documents/2013/04/16/2013-08855/infant-formula-the-addition-of-inimum-and-maximum-levels-of-selenium-to-infant-formula-and-related(accessed Nov 16,2022).

2.Bo L?nnerdal. Infant Formula and Infant Nutrition: Bioactive Proteins of Human Milk and Implications for Composition of Infant Formulas. The American Journal of Clinical Nutrition,Volume 99, Issue 3. [Online]2014,712S–717S. https://academic.oup.com/ajcn/article/99/3/712S/4577485(Accessed Nov 16, 2022).

注：AccQ-Tag? 和 ACQUITY H-Class? 是 Waters 公司的商标。Teflon 是Chemours（正式名称为 DuPont）拥有的注册商标和品牌名称。Discover Prep? 是 CEM 公司的商标。