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直播回看|超速连续流离心革新AAV载体大规模高效纯化工艺
发布:艾本德中国 Eppendorf China浏览次数:48AAV 商业化生产挑战
尽管 AAV 基因治疗药物发展前景广阔,但目前商业化生产仍面临诸多挑战。
纯化过程中杂质的去除:AAV 载体生产过程中会产生多种杂质,包括宿主细胞蛋白、DNA 片段杂质、空壳颗粒和未完全装配的病毒颗粒等。有效去除这些杂质,特别是与 AAV 颗粒大小和密度相近的杂质,是一个重大挑战
保持 AAV 载体活性和稳定性:在纯化过程中,保护 AAV 载体的生物活性和稳定性至关重要。不当的处理条件(如极端 pH、高剪切力、有机溶剂等)可能会降低病毒颗粒的感染力或导致其结构破坏
不同批次产品的一致性:在大规模生产中保持纯化工艺的一致性和可重复性是另一个挑战,这对确保每一批次产品的质量和安全性都符合高标准至关重要
分析和检测:开发敏感且特异的分析方法来准确测定 AAV 载体的滴度、纯度(如空壳比率)、完整性和生物活性是一大挑战,尤其是在高通量生产条件下
高成本:AAV 载体的纯化步骤复杂,尤其是在大规模生产时,往往需要多步柱层析、密度梯度离心等技术,这些步骤不仅耗时而且成本高昂【4、5、6】
AAV 分离纯化新策略
为应对这些挑战,相关的研究人员不断优化现有技术和开发新的工艺策略,如改进离心技术、高分辨率层析材料、膜过滤技术以及采用自动化连续流工艺等,以实现降本增效。
其中,值得一提的超速连续流离心技术是一种高效分离纯化方法,特别适用于大分子复合物以及包括 AAV 在内的病毒载体等颗粒的分离和纯化。在实现 AAV 的分离时,该技术利用强大的离心力场,结合连续流动的特性,能够在较短的时间内达到高度的纯化效果。
操作步骤与技术原理为:
1
密度梯度介质的准备
首先,需要制备一个密度梯度,这通常涉及使用不同浓度的密度梯度介质。这些介质能够形成一个从上至下密度逐渐增加的梯度,为后续的离心分离提供基础
2
样品装载
将含有 AAV 颗粒的样本小心装载到密度梯度的顶部。由于 AAV 颗粒具有特定的密度,它们会在离心过程中按照其密度分布到相应的梯度层
3
超速离心
使用超速离心机以非常高的转速进行离心。这种高速产生的强大离心力能够迫使不同密度的物质根据其沉降系数在梯度中分离。AAV 颗粒因其独特的物理特性会与杂质分离,空壳病毒、中间产物、碎片等会根据其密度和形状分布在不同的梯度区域
4
连续流
在某些超速离心技术中,如连续流离心,样品在离心的同时会被不断注入并流出系统,这有助于维持稳定的离心条件并连续提取目标成分。这种方法可以提高分离效率并减少处理时间
5
梯度收集
离心结束后,通过分段或连续收集技术,逐层或连续地收集包含纯化 AAV 病毒颗粒的梯度层。这一步骤可能涉及自动化的收集系统,确保精确收集目标组分
6
洗脱与重构
收集到的 AAV 颗粒通常需要经过洗涤以去除残留的梯度介质,并可能需要进一步的处理来重构或稀释,以便于后续的应用或分析
7
分析与验证
最后,通过诸如 ELISA、qPCR、SDS-PAGE、质谱或电子显微镜等方法对分离纯化的 AAV 进行质量控制,包括测定滴度、空壳率、生物活性等指标,确保分离纯化的效果
超速连续流离心的大规模 GMP 生产能力
与传统的超速离心技术相比,超速连续流离心技术的存在多方面优势,如:(1)连续流技术允许样品在离心过程中连续输入和输出,提高了处理效率,适合大规模生产,而传统超速离心通常是批次处理方式,意味着需要先加载所有样品,然后进行离心分离,之后再卸载和清洗,这一过程可能较为耗时;(2)连续流技术通常配备有自动化控制系统,减少了人工干预,提高了分离的精确度和重复性;(3)连续流离心被认为对样品的处理更为温和,可能减少对 AAV 结构和活性的损害,尤其适用于对完整性要求高的病毒载体;(4)虽然初期设备投资可能较高,但长期来看,通过提高效率和减少人力成本,整体成本效益可能更优,而传统超速离心通常需要多批次处理,这往往会导致较长的实验周期,同时需要消耗更多的人力、试剂和耗材。
陈海峰等人的研究数据显示,通过单次超速连续流离心步骤可以在碘克沙醇梯度中获得较高纯度 AAV 载体,回收率超过 50%。此外,他们发现,可以通过向碘克沙醇溶液中加入盐,以增加密度梯度溶液的离子强度,进而去除其中的部分微量杂质,进一步提高了 AAV 的纯度。而重复超速连续流离心却没有进一步提高 AAV 的纯度,由此可见,单次超速连续流离心纯化即可获得高纯度的 AAV 样本【7】。
总之,传统超速离心在实验室研究和小规模制备中较为常见,操作灵活但效率和规模有限。而连续流超速离心技术更适合于大规模生产,具有高效、快速、自动化程度高等优势,但可能需要较大的初期投资。选择哪种方法取决于具体的实验需求、样品量、成本预算以及对纯度和产量的要求。
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如您想了解更多 AAV 纯化相关的前沿分享,可以观看下方的讲座回放:
讲者:张玉蕊 副总裁,北京荷塘生华
内容亮点:
▲ AAV 药物在大规模生产工艺中的难点
▲ AAV 不同纯化方式的对比及案例分享
讲者:李品珍 市场经理,艾本德中国
内容亮点:
▲ AAV 下游纯化工艺的挑战
▲ 密度梯度离心工艺放大纯化方案
参考资料:
1、https://mp.weixin.qq.com/s/EDykpol-rjcUlh7T_YRtlw
2、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.1001263/full
3、https://finance.sina.cn/stock/med/2023-02-24/detail-imyhuuvr1703157.d.html
4、https://mp.weixin.qq.com/s/pjkweYHsNpZy8y36UGxoEw
5、https://mp.weixin.qq.com/s/8yHfxMyM9a0uyc-zXpYApg
6、https://mp.weixin.qq.com/s/MyiirNikvQkd8UV1OEvjog
7、https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S1525-0016%2816%2932906-9
2024-07-04相关仪器 -
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