RNA结合蛋白(RBP)可通过细胞内的无膜细胞器(MLO)调控基因表达。Rim4是酿酒酵母细胞中的一种RBP,能够形成减数分裂所需的淀粉样蛋白聚集。当出现温度升高等环境变化导致细胞应激时,Rim4浓缩形成可逆的应激颗粒(图1C)。
图1 A:Rim4蛋白结构域和减数分裂示意图;B:AlphaFold预测的Rim4的三维结构;C:减数分裂前期I的细胞中GFP-Rim4在不同的条件应激下形成foci。
近期,发表于bioRxiv的一篇文章利用超精准可调节温度控制模块-VAHEAT对活细胞内温度诱导相变进行了深入研究[1]。
研究人员将酵母细胞悬液滴加在VAHEAT的智能基板上并放置于显微镜适配器中,连接上VAHEAT控制器,即可实现对细胞样品的温度控制。VAHEAT可在0.1s左右使样品到达实验所需的温度并稳定控温。当加热至一定的温度,且经过一定时间后,Rim4即可浓缩形成foci,并主导细胞质应激颗粒的生成(图2D-图2F),颗粒中含有酵母应激颗粒的标记物Pab1 (图2G&图2H),以及mRNA(图2I)。
图2 D:不同温度下Rim4随时间推移形成foci;E:图1D中不同温度下信号强度的标准差;F:图1D中不同温度下细胞内的平均foci数量;G&H:加热后与未加热的Pab1和Rim4的共定位;I:加热后与未加热的FISH结果。
Rim4含有三个RNA识别基序(RRM),由内在无序区域(IDR)连接,而IDR能够引导Rim4 foci的形成。IDR残基Rim4 (IDR3)在细胞没有因温度升高导致应激时也可以聚集形成foci,而C端IDR切除后的Rim4(△IDR3)在温度升高时的foci形成明显下降,以上结果说明Rim4在没有mRNA时也可以由IDR引导自组装形成foci(图3)。
图3 上:GFP-Rim4,GFP-Rim4(∆IDR3)和GFPRim4(IDR3)的示意图;下:上述Rim4及变体在加热前和加热后的分布。
实验发现,尽管Rim4在细胞核和细胞质中均等分布,温度升高时生成foci的主要是细胞质中的Rim4。研究人员使用了具有RNA结合缺陷的Rim4(FLm)突变体,其仅有一个功能正常的RRM,相对于野生型的RNA结合下降,但不会自组装。加热后,细胞核中的Rim4(FLm)迅速形成了foci(图4),这说明RNA结合能够抑制Rim4的自组装。
图4: 加热后细胞核中Rim4(FLm)形成foci。
根据以上结果,研究人员使用了一个热诱导产生减数分裂应激颗粒的模型(图5)。
图5 Rim4自组装后结合RNA和RBP形成应激颗粒的过程
在细胞质内的Rim4 foci形成的开始阶段(42˚C, 10 sec),与Pab1几乎没有共定位;Rim4 foci完整形成后(42˚C, 5 min),能够与Pab1结合(图6)。
图6 加热时,Rim4首先形成foci,然后与Pab1结合。
研究人员检测了温度升高导致的Rim4自组装和减数分裂应激颗粒的生成对减数分裂和孢子形成的影响。结果表明,减数分裂间期Ⅰ细胞的细胞自噬标记蛋白Atg8与Rim4 foci在温度变化及回复期间均未发生共定位;不同时期的细胞裂解后,裂解液中的Rim4蛋白水平在加热过程中和加热后恢复时没有改变(图7),说明Rim4的浓缩能够使其在细胞应激时也能够保持稳定,直到减数分裂时再分解,进而启动减数分裂中后期的翻译过程。
图7 左:未加热,加热中和加热后,Atg8与Rim4均未发生共定位;右:不同时期细胞裂解液的Rim4水平未受细胞自噬影响。
综上所述,减数分裂特异性的RNA结合蛋白Rim4,经过热刺激诱导形成可逆的应激颗粒,通过抑制翻译来抑制减数分裂以防止减数分裂错误。热刺激诱导的Rim4 foci能够进行自组装,并且结合mRNA和其他RBP如Pab1。未来的研究方向应是阐明由Rim4驱动的减数分裂应激颗粒的组成和功能,以及Rim4如何转换其蛋白质状态以执行功能。
在以上研究中,VAHEAT能够对样品直接、快速地加热至所需温度并保持恒温,且适配多种荧光显微镜以实现样品的实时快速成像。该技术来源于德国著名的马克斯-普朗克研究所 (MPI) ,兼容市面上绝大多数的商用显微镜和物镜,可在高清成像的同时快速和精确地调节温度,加热速率可达100℃/s,Max温度可达200℃,稳定性0.01℃。该模块自2021年问世以来,已在《Journal of the American Chemical Society》、《Small》、《EMBO Journal》、《Nature Communications》、《Nature Methods》、《Nature Nanotechnology》等高水平期刊发表数十篇文献。
图8 VAHEAT实物图
图9 A: VAHEAT 各部件名称B: VAHEAT 配有容纳液体样品的智能基板,可安装在显微镜上C: VEAHEAT 智能基板含有氧化铟锡 (ITO) 加热元件和温度探头
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参考文献:
[1]. Zhang, R., Li, S., Feng, W., Qian, S., Chellappa, A. J., & Wang, F. (2024). Rim4 is a Thermal Sensor and Driver of Meiosis-specific Stress Granules. bioRxiv.