技术分享一如何使用荧光定量qPCR进行高阶的单核苷酸突变分析(SNP Gene Scanning )-2024

该方法可生成DNA熔解曲线图谱，这些曲线图谱（图01）具有特异性和灵敏度，足以区分探索性环境（突变扫描—发现未知遗传变异）和常规检测已知变异（基于探针的靶向基因分型或基于参考曲线的更无偏技术对确定的多个单核苷酸多态性（SNP）进行基因分型）中的核酸变异, 自2003 年HRM技术发明以来，该技术已被临床化学、人类病理学和动植物科学、微生物学所采用,  SNP基因分型成为动植物取证、微生物菌种鉴定、EMS突变育种筛选、胚胎CRISPR/Cas9基因编辑频率分析等领域基因研究的重要部分。

SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（Transition）或颠换（Transversion）所引起，也可由小范围碱基的插入或缺失所致。在可能存在的单碱基多态性中，A突变成T的4级SNP是最难解决的，因为纯合基因型在其TM中的差异最小（通常仅约为0.2°C）。

已知突变(NGS/Sanger验证)的客户UN样本扫描

用来检测已知突变最常用的基本方法是利用酶裂解水解探针(Hydrolysis Probe)进行终点法基因分型。(图02，图03)

图02.终点法基因分型的双色检测原理。

通过PCR扩增收集数据。但是，仅利用这两种指示剂染料的终点信号强度来识别不同的基因型。染料相对强度可通过散点图清楚地显示出来，简化了对纯合X、纯合Y和杂合样本的识别。

图03.信号强度分 布相似的样本被集合成一个组。可把每个组视为一种基因型。通过双通道(两种染料)检测每个样本的强度。(使用LightCycler? 480软件终点法基因分型模块。)

未知突变的UN样本扫描

基因扫描用来发现含有靶基因的扩增子中的新突变。可通过加入饱和的DNA结合染料在高分辨率下分析此类扩增子的熔解行为，方便地进行此类扫描。(参见图4)

1. 原理和定义：基于高分辨率熔解曲线的基因扫描

通过在PCR之后的高分辨率条件下收集到的熔解曲线数据，在不同用特异性探针的情况下，便可获取未知突变有关的信息。高分辨率熔解法（HRM）只需用到PCR试剂，用于相关基因扩增的简单引物对，饱和DNA结合染料，以及一台精准的实时PCR仪。LightCycler? 480 实时PCR系统的软硬件和试剂都已针对此类要求进行优化。

当存在SNP（通常为杂合）时，将在PCR、熔解和重退火后出现同源和异源双链DNA。由于杂交链之间的序列不匹配，异源双链DNA的熔解温度不同于同源双链DNA。当使用饱和DNA结合染料，如LightCycler? 480 ResoLight时可检测出熔解温度上的差异（表8和9），可检测出在PCR过程中形成的异源双链（如当待测样本与特定的突变杂合时）。所以其应用范围比其他较传统的DNA染色染料－如SYBR Green I更为广泛。因其对PCR扩增酶不具有毒性，因此染料的高浓度对PCR无影响。高浓度染料完全掺入样本中的dsDNA。因此，当在熔解过程中染料分子脱离dsDNA时，它们再度与其他空置位点结合的机会微乎其微。这使得熔解过程高度相似，产生的信号也很强。在此种条件下，熔解曲线即使出现很小的变化也会使荧光信号产生轻微但可重现的变化。

当在差异图中显示时，熔解曲线数据将识别出样本不同集群（如纯合野生型、纯合突变型和杂合型）（图04）。

图04.PCR后高分辨率熔解生成的荧光信号分析差异图。对原始熔解曲线数据进行归一化处理，形成差异图。由此产生的差异图根据其熔解曲线的形状，把样本归入不同的组。（具体示例参见LightCycler? 480基因扫描软件模块）

目前HRM高分辨率熔解 （HRM）是一种封闭管式的、PCR后的分析方法, 分析关键是依赖于两类核酸荧光染料，如今普遍使用的2代非饱和核酸荧光染料 SYBR-Green I(出自Thermo Fisher) , 非饱和染料用于HRM实验超过40个循环数以上在进行扩增产物熔解曲线分析时, 可能会存在高浓度抑制效应和信号掉落不均一\重排现象, 无法适用更精细的高分辨率熔解曲线分型实验(比如A-T替换或2nt-4nt的删除).

三代升级的饱和荧光染料 LC Green/LC Green Plus(出自Idaho Tech)、ResoLight(出自Roche Diagnostics) 和 SYTO9(出自Invitrogen Corp.), EvaGreen(出自Biotium Tech), 这些饱和染料在dsDNA解链时，荧光分子同步脱落且不会存在高浓度抑制效应, 和DNA结合的更均匀, 50%的dsDNA解链为ssDNA信号最低, 会形成更为特异的熔解曲线差异图(Tm peak shift). 非常适合反映基因扫描实验结果，因为饱和染料的使用，当扩增子长度约为 300 bp 时，基于Resolight或 Eva Green 的HRM分析实验可有效检测 SNP 或其他突变, 大大提高了HRM在SNP、小片段Indels方面检测的灵敏度和分辨率。

图05.2代核酸荧光染料和3代核酸荧光染料适用HRM模式差异(引自: Corbett Life Science)

Tips: (饱和荧光染料的应用场景包括不限于 qPCR 和 DNA 熔解曲线分析、HRM?、LAMP、数字dPCR、嗜热解旋酶依赖性扩增 (tHDA) 的实时监测、毛细管凝胶电泳等)

其中三家饱和染料品牌(SOYO9, Resoslight Dye, LC Green plus)在处理大量样品时，如果使用者的实验条件未前期优化, 经济成本可能会大幅增加。高负荷的成本限制了这项技术的实际使用, 目前经过科学家多个平台的平行对比研究实验,  EvaGreen可能是一种更经济的 DNA 螺旋小沟结合染料，已用于目前qPCR 常规定量和扩增子HRM熔解曲线分析产物。比如(Li.,Zhu.,2010等) 进行两种染料的同等检测。EvaGreen染料在五重混合样品中发现SNP时同样灵敏。使用这种经济的染料，他们成功地鉴定了玉米EMS突变体库中的Gln1-3基因多个新的突变等位基因; (Lochlainn,S.ó,2011等使用Eva Green这类染料有效地分析使用TILLING方法生成的模式植物拟南芥等位基因系列突变体，相比高通量模式的Sanger测序，成本花费减少70%。

经典案例1: 斑马鱼CRISPR/Cas9模型-筛选突变体胚胎的gRNA文库编辑效率分析(Samarut, é., Lissouba, A,2016)

经典案例2: 高通量筛选生物银行库中镰刀型贫血症患者β-goblin蛋白的等位突变体分析(Herrmann et al 2007)

HRM的数据分析是通过比较不同样本之间熔解曲线的位置和形状上的差异，来对基因型进行区分的。标准的HRM软件包能够将样本熔解曲线的形状和位置与对照进行比较。针对杂合突变样本的同源位点突变, 若未对形状做优化，将无法区分各个同源变异。目前用已知数量的野生型DNA人工掺入，所有样本可解决这一问题，从而明确地区分同源变异(可参见Lightcycler480II Gene scanning module分析结果 图06).

图06.SNP分析:在PCR之前在所有未知样本中添加固定数量(10-20%) 的已知同源DNA,可识别不同同源基因型以及杂合型的熔解曲线。(蓝色: .同源野生型，红色:杂合，绿色:同源突变型)。

HRM实验成功设计方案要点

1.保持较短的扩增片段，实现最高的灵敏度。与较大的扩增片段相比，100 bp 左右的扩增片段可简化单核苷酸熔解曲线的检测。如需要分析的只是已知多态性的某些热点或位点，选择短扩增子（<150 bp）为佳。

2. 始终使用高纯化（如HPLC纯化）避免错配产物和引物二聚体, 可使数据解释复杂化确保 PCR产物的特异性: 引物浓度低于 200nM，MgCl2 在 1.5 mM至3 mM 范围及使用热启动DNA 聚合酶将有助于获得高特异性,必要时使用Touchdown PCR或多对引物方式进行检测.

3. 确保反应使用足够的模板。一般而言，Cp值(Ct)＜30，以生成足够的分析材料，实现准确的熔解曲线分析。

4.使用Primer3设计引物, 检查PCR产物的特异性（如在琼脂糖凝胶上）。记住，含有引物二聚体或非特异性产物的反应不适合用于HRM分析。

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