MBP标签蛋白纯化案例分享及常见问题

MBP是细菌周质结合蛋白家族的一员，是一种单链双结构域的单体蛋白，不含二硫键和辅因子，参与麦芽糖的转运和内膜受体的趋化效应；

MBP和麦芽糖分子间的亲和力在1 μM左右，其蛋白分子量大于40 KD，等电点PI=4.9，在pH 4-10.5的条件下较为稳定；

MBP可添加于目标蛋白的N端或者C端，其中N端更为常见^[2]；

全长的MBP前体含有N端信号肽可以将融合蛋白引导至周质区，周质区的氧化环境有利于二硫键的形成，利于部分蛋白的稳定和折叠^[3]；

MBP融合蛋白通常利用糊精亲和填料进行纯化，也可以使用其他亲和方法进行分离（例如将DARPin off7蛋白作为亲和配基纯化MBP融合蛋白^[4]）。

Dextrin Sepharose填料

纯化案例分享

常见问题

MBP融合蛋白可以在变性条件（盐酸胍或者尿素）下纯化么？

不可以，MBP蛋白和填料上的配基糊精是通过氢键结合^[5]，因此需要MBP蛋白具有三维结构，盐酸胍和尿素这类变性剂会破坏氢键，导致蛋白不挂柱。

MBP层析柱随着使用次数的增加，载量越来越低是怎么回事？

样品粗提物中的淀粉酶会影响MBP蛋白挂柱以及层析填料的寿命，所以建议在大肠杆菌的LB培养基中添加0.2%的葡萄糖来抑制部分淀粉酶的表达^[6]。

纯化过程推荐哪些缓冲液？

Tris、磷酸盐、MOPS、HEPES缓冲液均可，缓冲液浓度建议在20 mM，缓冲液pH建议在7.5-8.0之间，盐离子浓度建议100-500 mM。

MBP标签纯化过程中，结合比较弱或者出现流穿。

如果蛋白沉淀在柱上，则需要降低上样量，并降低样品的粘度。如果样品流穿，需要检查样品和缓冲液的pH和成分，是否添加了变性剂和去垢剂，保证缓冲液pH>7。检查融合蛋白是否发生降解。如果标签暴露不够充分，需要更换标签和目标蛋白之间的linker。

哪些添加剂会影响MBP融合蛋白的纯化？

10%以上浓度的甘油、非离子型去垢剂如 (Tween 20、Triton X-100) 均不建议添加，0.25%的Tween 20会使结合效率降低到5%以下^[6]，此类去垢剂会严重降低样品的结合。如果样品需要处于还原条件，缓冲液中可添加1 mM DTT。

酶切MBP标签后，如何去除样品中的MBP标签和酶？

MBP标签较大，后续对蛋白进行功能研究时需要去除该标签。某些MBP的表达载体，在MBP的N端会有多聚组氨酸标签，另外很多酶会带有His标签，所以酶切后，可用镍柱进行杂质的去除。也可以利用离子柱进行纯化。MBP标签去除后，一定要关注蛋白的稳定性。

MBP纯化填料可以用哪些试剂做再生？

0.5 M氢氧化钠或者0.1%的SDS。注意：4℃条件下用0.1% SDS，随着时间的推移容易出现沉淀。

MBP和His双标签一般如何构建？

通常这类载体是在蛋白N端同时融合表达His标签和MBP标签，一般是His标签在前，MBP标签在后，并在MBP标签与目的蛋白之前添加酶切位点。MBP标签的融合表达有利于提高目的蛋白的表达量和稳定性，促进蛋白的可溶性和正确折叠，His标签可直接使用镍柱纯化，更为简单快捷。最后通过酶切就能一次性把两个标签完全移除。

MBP融合表达的蛋白仍然处于不可溶状态该怎么办？

如果是大肠杆菌表达体系，可以尝试降低培养温度（例如30℃或者15℃），如果仍然不可溶，考虑更换其他表达质粒或者表达系统。

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