文献解读 | 蛋白质组学样本制备-植物篇

2021年4月Kamil Mikulá?ek在期刊《Frontiers in Plant Science》发表一篇题为：“SP3 Protocol for Proteomic Plant Sample Preparation Prior LC-MS/MS”的文章。通过比较植物样本的4种制备方法，包括滤过辅助样本制备 (FASP) 、2种单罐固相增强样本制备（SP3 Carboxy和SP3 HILIC）和蛋白质悬浮捕获 (S-Trap) ，运用LC-MS/MS分析，在蛋白和多肽鉴定数量、蛋白质组覆盖率、重复性、处理时间、单位试验成本等方面以评估它们在去除SDS和蛋白质消化方面的效果。研究对象是拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 。

四种蛋白质组样本制备方法

FASP：过滤辅助样本制备，将样本溶液通过30kDa截留超滤膜，去除低分子量杂质，然后在膜上进行蛋白质消化。

SP3 Carboxy：单罐固相增强样本制备，使用羧基修饰的磁珠进行蛋白质结合和清洗，然后直接在磁珠上进行蛋白质消化。

SP3 HILIC：单罐固相增强样本制备，使用亲水相互作用色谱磁珠进行蛋白质结合和清洗，然后直接在磁珠上进行蛋白质消化。

S-Trap：蛋白质悬浮液捕获法，使用石英滤膜捕获蛋白质悬浮液，去除杂质，然后进行蛋白质消化。

研究结果

SP3 Carboxy方法的肽段回收率最高，且鉴定鉴定到的蛋白组数量较高。FASP仅次于SP3 Carboxy，SP3 HILIC方法略低，S-Trap方法最低。且连续添加胰蛋白酶有助于提高回收率，但消化时间对SP3 Carboxy方法影响不大。

对于低微克量的蛋白质输入，高比例的磁珠:蛋白质比例（如600:1）更有利于蛋白质组鉴定。高比例的胰蛋白酶:蛋白质比例（如2:1）可以降低肽段中不完全切割的比例，提高消化效率。因此，对于1 ug拟南芥总蛋白，推荐使用磁珠:蛋白质比例为600:1和胰蛋白酶:蛋白质比例为2:1，以获得最佳的蛋白质组鉴定结果。

使用SP3 Carboxy方法处理毫克级 (10 mg) 蛋白质输入时，高比例的磁珠更有利于肽段回收。优化后的SP3 Carboxy方法需要使用高比例的磁珠:蛋白质比例 (10:1) ，以获得最佳的肽段回收率，而胰蛋白酶量对肽段回收率没有显著影响。

对于低微克量的蛋白质输入 (≤10 μg) ，SP3 Carboxy方法鉴定到的蛋白组数量显著高于FASP方法。对于较高的蛋白质输入量，两种方法鉴定到的蛋白组数量相似。因此SP3 Carboxy方法在低样本输入量时具有优势。

经LCMS/MS分析，Venn图显示了两种方法鉴定到的蛋白质组之间的交集和独特部分。两种方法共有4,821个蛋白质组，占总鉴定蛋白质组的88%，具有很高的重叠性。两种方法的蛋白质组强度分布非常相似，定量重复性很高。鉴定到的肽段的GRAVY指数分布。SP3 Carboxy方法鉴定到的肽段在GRAVY指数上略偏向于亲水性，这可能与SP3 Carboxy方法中使用的磁珠和洗涤条件有关。表明SP3 Carboxy方法可以作为FASP方法的替代方案，特别是在需要快速、高效和成本效益高的蛋白质组学分析时，SP3 Carboxy具有明显的优势。

研究结论

SP3 Carboxy方法是一种高效、经济、操作简便的植物蛋白质组样本制备方法，特别适用于低微克量蛋白质输入。该方法可以有效地去除SDS和其他杂质，实现高效的蛋白质消化，并鉴定到更多的蛋白质组。与FASP方法相比，SP3 Carboxy方法具有显著的成本优势，并且可以显著缩短操作时间。该方法为植物蛋白质组学分析提供了一种新的选择。未来可以进一步优化SP3 Carboxy方法，例如开发自动化流程，提高方法的通量和效率。有望促进植物蛋白质组学研究的快速发展，并推动相关领域的研究进展。

SP3方案在不同样本输入量的快速Protocol

蛋白质提取：将植物组织粉末溶解于SDT缓冲液 (4% SDS，100 mM DTT；100 mM Tris-HCl，pH 7.6) 中，离心去除不溶性物质。

甲基化：加入碘乙酰胺进行蛋白质甲基化。

磁珠结合：将蛋白质与羧基磁珠6515和4515混合，让蛋白质结合到磁珠上。

洗涤：用AB缓冲液 (50 mM ammonium bicarbonate，0.1% formic acid) 洗涤磁珠，去除杂质。

蛋白质消化：在磁珠上加入胰蛋白酶进行蛋白质消化。

洗涤：用AB缓冲液洗涤磁珠，去除未消化蛋白质。

收集肽段：用AB缓冲液洗脱肽段，收集肽段溶液。

蛋白质提取：将植物组织粉末溶解于SDT缓冲液中，离心去除不溶性物质。

甲基化：加入碘乙酰胺进行蛋白质甲基化。

磁珠结合：将蛋白质与羧基磁珠6515和4515混合，让蛋白质结合到磁珠上。

洗涤：用AB缓冲液洗涤磁珠，去除杂质。

蛋白质消化：在磁珠上加入胰蛋白酶进行蛋白质消化。

洗涤：用AB缓冲液洗涤磁珠，去除未消化蛋白质。

收集肽段：用AB缓冲液洗脱肽段，收集肽段溶液。

额外洗涤：用AB缓冲液额外洗涤磁珠，收集肽段溶液。

混合：将收集的肽段溶液与额外洗涤液混合。

保存：将混合后的肽段溶液保存于-80°C备用。

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