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如何成功进行活细胞光电关联
发布:徕卡显微系统(上海)贸易有限公司浏览次数:74Coral Life工作流程
Coral Life 提供了简化的活细胞 CLEM 解决方案,用于深入了解细胞成分随时间发生的结构变化。除了工作流程手册中描述的技术处理外,本文还提供了成功进行实验的其他知识。
在本例中,主要关注点是两个有丝分裂细胞的Z终分离,即脱落。胞质分裂后,两个分裂细胞仅通过细胞间桥相连,这细胞间桥还需要被进一步研究。由于其体积庞大,活细胞成像无法完全了解这一机制。因此,需要通过超微结构分析来了解Z终细胞分离的内在机制。
6 毫米蓝宝石盘需要在实际实验前进行清洁。清洗步骤如下:
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在通风橱中将蓝宝石盘放入浓盐酸(HCl 30%)中浸泡 2 小时。
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用双蒸(dd)H2O 冲洗蓝宝石盘 3 次,每次 5 分钟。
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之后将蓝宝石盘放在滤纸上晾干。
清洗过程结束后,需要在干净的蓝宝石盘上喷镀出网格图案。这一步至关重要!该图案可确保日后在树脂块中轻松检索样品位置和感兴趣的区域。在蓝宝石上绘制图案的步骤如下:
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将一个干净的蓝宝石盘放入镀膜安装座的每个相应位置,并在上面添加一个 6 毫米的finder栅格掩模(图1)。Finder 栅格掩膜外围有一个凹槽,用于指示掩膜的方向。所有掩膜应具有相同的方向,以便在后续步骤中始终显示蓝宝石的正确方向。建议将finder光栅掩模放在能产生可读字母的方位。
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对于掩膜的喷镀,可以使用金或碳。在此,使用 EM ACE 600 碳线以脉冲模式(双线、100 毫米距离、210 瓦、150 毫秒脉冲长度)进行碳涂层。在蓝宝石上沉积了厚度为 10 纳米的碳层。
确保关闭旋转。这将使网格图案更加清晰。
根据镀膜仪和喷镀技术的不同,可能需要喷镀更厚的碳层才能获得良好的可见度。
如果使用碳,不要忘记将碳层稳定在 180 摄氏度以上过夜。
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现在蓝宝石已准备就绪,可以按照工作流程手册的说明设置 SampLink chamber。确保碳层朝向 SampLink chamber的内部。细胞需要在碳层顶部生长。
图 1:蓝宝石上用于后续喷镀的finder栅格掩模的方向
在将细胞种植到组装好的 SampLink 细胞室之前,需要再次对细胞室进行清洁和灭菌。在细胞培养罩中执行以下步骤:
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在SampleLink中注入 1 毫升 70% 乙醇并孵育 5 分钟。
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用 dd H2O 冲洗 3 次。
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让其干燥过夜。
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紫外线灭菌至少 1 小时。
第二天:
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用 PBS 冲洗 3 次。
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加入 1 毫升 PBS 或培养基,将SampleLink放入培养箱中过夜。
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培养结束后用 dd H2O 冲洗。
SampleLink即可使用。将细胞直接种在蓝宝石上,或种在附加的聚合物或多肽涂层上。在这里,蓝宝石上的碳网格图案上涂有聚-L-赖氨酸(broid P1274,分子量 70,000-150,000 ,Sigma-Aldrich)。涂层用 0.1 mg/ml dd H2O 稀释。在每块蓝宝石上加入 50μl 5 分钟,然后冲洗(3 次 dd H2O),并在通风橱中干燥 2 小时。
这些实验使用了在 DMEM 培养基(10 % FCS ,1 % 青霉素/链霉素)中培养和孵育的 HeLa Kyoto HKF1、H2B-mCherry、alphaTubulin、mEGFP 细胞系。
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每个SampLink chamber培养66,000个细胞,在37°C、5% CO2 条件下培养 24 小时。
在标准细胞培养箱中,将 6 个开放的 SampLinks 放入 140 毫米的培养皿中,然后盖上培养皿。在实际成像实验之前,需要将 SampLinks 完全组装好。按照 Coral Life 手册第 5.2.4 节的说明组装 SampLink 室。
如果直接在 OxyGenie 中培养 SampLinks,则需要在播种后直接组装 SampLinks chamber。注意:OxyGenie 需要 30 分钟左右加热。
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在这些实验中,培养 24 小时后细胞的密度达到约 70%。
一旦细胞达到所需的密度,6个SampLink chamber就可以安全地从细胞培养实验室转移到显微镜实验室。
若THUNDER显微镜与SampLink chamber一起用于成像,以下是一些关于成像参数的提示和技巧:
图 2:这里显示的是螺旋扫描的一部分。在透射光下,碳涂层网格图案清晰可见。
通过定位字母 I、J、O、P(箭头)可以很容易地找到网格图案的中心(星号)。
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设置平台的转移位置,以便之后轻松卸载SampLink chamber进行冷冻。
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生成定位概览:
根据网格图案手动识别蓝宝石片中心(见图2)。
确定后,从中心开始快速螺旋扫描,覆盖整个区域,以获得初步的快速概览。这样可以快速检查方向。此处直接使用 40x 水浸物镜。
为了进一步识别感兴趣的区域,还进行了带焦点图的螺旋扫描。这样做的好处是,如果蓝宝石片或chamber不完全平整,焦点就会得到修正。可以在多个通道中创建带聚焦图的序列扫描(图3)。建议逐个通道运行,完成后再合并。
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完成后,确定感兴趣区域 (ROI),如图 4 所示。每块蓝宝石片可以使用一个以上的 ROI 进行下游分析。但必须确保区域之间有足够的空间,以便修整或分割树脂块。
图 3:使用 40x/1.1 NA 蓝宝石校正水浸物镜采集的螺旋扫描图。A)透射光;B)荧光通道--510 纳米波长照明。
在本示例中,观察从细胞分裂开始。60 分钟后固定样本。根据相关过程的动态变化,您需要选择不同的成像时间间隔。就本文而言,每分钟 1 张图像足以跟踪细胞分裂和脱落。
A:使用 40x/1.1 NA 蓝宝石校正物镜获得的螺旋扫描图像。B:放大的 A 中圆圈所示区域。感兴趣的分裂细胞位于中心。
本例中使用的是整体冷冻替代方案。这种技术可在样品内部进行强烈的金属染色,从而在扫描电镜成像时获得良好的对比度。它也可用于 TEM 成像;不过,由于脂质上的强金属堆积,分辨率会略有降低。在高倍放大镜下,样品会显得模糊不清。所使用的冷冻替代液含有 1% OsO4 + 0.2% 醋酸铀酰 + 2.5% H2O 的纯丙酮。
将样品在液氮下放入冷冻替代液中,然后转移到-90°C的预冷 EM AFS2 系统中:
冷冻替代
-90°C,在冷冻替代液中放置 48 小时
每小时升高 5 摄氏度,直至 -30 摄氏度
保持 -30°C 4 小时
以 5°C/h 的速度递增,直至 20°C
保持 20 摄氏度 5 小时
对比
在丙酮中清洗 3 x 10 分钟
在丙酮中加入 1% 的硫代酰肼,在室温条件下 20 分钟
在丙酮中清洗 3 x 10 分钟
2% 四氧化锇在丙酮中,室温条件下 20 分钟
在丙酮中洗涤 3 x 10 分钟
2% 醋酸铀酰,丙酮,60°C,20 分钟
在丙酮中清洗 3 x 10 分钟
渗透
30% Durcupan 在丙酮中浸泡 3 小时
70% Durcupan 在丙酮中浸泡 3 小时
100% Durcupan 3 小时
100% Durcupan 过夜
100% Durcupan 3 小时
60°C 下聚合 48 小时
包埋完成后,将通流环 (16707161) 放入试剂槽 (16700154) 并注入一半的新鲜树脂。将蓝宝石转移到通流环中,用体视显微镜检查finder栅格的可读性(图5)。然后,将通流环完全填满,并将样品放入 60°C 的烘箱中 48 小时。
工作流程中Z关键的步骤之一是取回树脂块中的 ROI,然后进行修块和成像。为了检查样品是否保存完好,建议在聚合后对树脂块的块面进行快速成像。在本实验中,将光学显微镜的数据与树脂块表面的图像进行了如下关联:
将样品从聚合的流动环中取出后,用手术刀从蓝宝石背面刮去残留的树脂薄层
用乙醇浸湿的纸巾清除残留碎屑
用金属夹具将样品块固定在THUNDER显微镜载物台上,使蓝宝石片(几乎)垂直于显微镜的光轴
通过树脂块的透射照明可用于成像
或者,也可利用树脂块在蓝光(470纳米)下的自发荧光对细胞进行“背照”
首先使用螺旋扫描对树脂块进行定位
然后绘制包含 5 个聚焦点的聚焦图和整个块面的图像扫描图
将扫描图像与概览图像合并,并导出为 tiff 和 jpg 文件
jpg 文件可通过 Microsoft Office 的成像工具以正确的放大率叠加到活细胞图像上;使用 tiff 文件和 Fiji 软件可完成更复杂的叠加程序
图 5:左:透过蓝宝石拍摄的块面透射光图像。右图 块面图像与之前活体成像的相应荧光图像的叠加。
注:在高压冷冻过程中,单个细胞或有时成批细胞从蓝宝石上脱落是正常现象。高密度或与基底结合不牢固的细胞(即有丝分裂细胞,因为它们会变圆,因此与基底的附着点会减少)会产生这种效果。使用较低的细胞密度和/或不同类型和浓度的涂层可以减少玻璃化过程中细胞的损失。
然后将蓝宝石从块面上剥离:
1
首先修剪掉蓝宝石周围过多的树脂。这可以用厚重的刀片来完成。
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加热 EM MP 系统 (16705403),准备一个装有 LN2 的小杜瓦瓶。
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用镊子夹住树脂块
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将树脂块正面朝下放在热的 EM MP 上 10-20 秒。
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然后将树脂块直接浸入液氮中冷却。您会听到“咔嚓”一声。
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用体视显微镜观察时,将锋利的刀片插入树脂和蓝宝石片之间。蓝宝石片应该很容易与树脂分离。否则,请重复加热/冷却步骤。
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移除蓝宝石片后,您应该仍能观察到区块上的碳图案。
利用finder栅格的网格图案,您可以在区块上找到 ROI 并将其修剪下来。在这里,使用 EM TRIM2 对包埋块进行了修整。
在本例中,由于只有 5-7 个部分包含目标特征,因此必须进行序列切片。因此,切片被安装在slot grids上。由于使用了整体冷冻替代和渗透方案,因此无需进行后期染色。
图 6:分裂的 HeLa 细胞的合并 TEM 图像,仍由细胞间桥连接。样品用 Morgagni 80 kV TEM( Thermo Fisher)成像。
图 7:分裂的 HeLa 细胞的 TEM 图像,仍由细胞间桥连接。
本实验使用THUNDER技术对原始数据进行后处理。要了解有关THUNDER技术的更多信息,以及如何在 Coral Life 工作流程中使用THUNDER技术进行后处理和定位,请扫码查阅应用说明:“如何使用 Coral Life 改进活细胞成像”。
图 8:A) 感兴趣细胞的标准 WF 图像,使用绿色和红色荧光通道成像。B) 使用THUNDER小体积计算技术对数据进行后处理。
Z终的图像相关性取决于每个实验的要求,可以是将不同的图像结果并排放置,也可以是更详细的二维和三维图像相关性,从而提取超微结构和活细胞数据之间的关系。在本例中,创建了 LM 和 EM 数据的叠加。为了进行匹配叠加,需要在光学显微镜和电子显微镜图像上放置地标。为此,需要叠加无褶皱变形的图像。
光学显微镜和电子显微镜图像的叠加。
图 9:光学显微镜和电子显微镜图像的叠加。
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2024-04-03 -
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