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利用扫描成像流式细胞仪估算港口凯伦藻赤潮动态及生长率

发布：上海泽泉科技股份有限公司

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? 将自动流式细胞仪与图像处理的细胞图像流相结合，可以估算藻细胞生长率;
? 凯伦藻（Karenia selliformis）在赤潮期间表现出低生长率;
? 在藻华期间，Karenia selliformis可能存在磷限制;
? 潮汐动态在Karenia selliformis生物量积累中起着关键作用。

摘要

2019年秋季，在加贝斯湾（地中海）发生了一次凯轮藻（Karenia selliformis）赤潮事件，利用配备流动成像模块的自动流式细胞仪（Cytosense, Cytobuoy b.v.）进行了为期9天的高频监测。该仪器记录了光学信号的形状，从而分辨了有害藻类大量繁殖期间的六个细胞群，包括微微型浮游植物 (picophytoplankton)，微型浮游植物 (nanophytoplankton)和小型植物型浮游植物 (microphytoplankton)。通过分析每小时记录得到的凯轮藻细胞尺寸，估算了赤潮期间的日分裂率。结果显示，凯伦藻是唯一形成赤潮的物种，并在调查的第四天达到了最高的平均丰度。营养盐组成发生了变化，赤潮爆发期可能存在磷（P）限制，而大赤潮衰退期可能存在氮（N）限制。协惯量分析显示，凯伦藻和异养原核生物呈相反的模式，表明了它们之间的营养相互作用以及赤潮结束时凯伦藻可能出现混合营养行为。凯伦藻的生长率普遍较低，通常日分裂率<1/d，此数值无法解释观察到的高丰度。潮汐在半日和春潮-露潮尺度上对凯伦藻动态起着至关重要的作用，并可能增强了凯伦藻的积累。

在这项研究中，报告了对加贝斯湾中凯伦藻进行高频率原位监测的结果。以小时为单位时间尺度对赤潮动态进行了调查，以解决以下问题：（1）观察到的赤潮是否为单一种类，并且是否与其他浮游植物群体，尤其是超微型浮游植物（<10 μm），存在相互作用？（2）凯伦藻在赤潮期间的养分需求是什么，赤潮期间养分组成是否发生了变化？（3）在赤潮期间，高生物量是否由纯物理过程维持，还是由于种群的内在固有特征（即，高生长率）？

材料与方法

采样区域

取样是在2019年秋季（从9月27日至10月5日）在突尼斯斯法克斯（Sfax）的商业港口进行的，此前当地政府报告了水体变色情况。斯法克斯港口位于加贝斯湾北岸的工业区域内，该地区是突尼斯海岸沿线赤潮事件的主要热点区域（见图1）。大多数事件发生在秋季和春季，而主要的有害赤潮物种是凯伦藻属（Karenia selliformis）（Feki等人，2017年）。尽管属于东地中海盆地寡营养区，但加贝斯湾非常富有生产力，占突尼斯渔业生产的65％（DGPA，2005–2009）。它是海龟的知名栖息地（Jribi等人，2008年；Lotze和Worm，2009年；Maffucci等人，2006年）。尽管加贝斯湾对当地经济和野生动物保护具有特殊重要性，但仍然受到城市化、工业、渔业、旅游和人为排放的强大压力（B′ejaoui等人，2004年；Ben Brahim等人，2010年；Rekik等人，2012年）。

水文要素

采样使用手持式多参数仪器（WTW Multi 340i/SET）对温度、盐度和pH进行了每小时的测量。潮汐振幅，即高潮和落潮之间的差异，被视为表示潮汐影响的变量，从位于斯法克斯港口的潮汐测站获取，由突尼斯海洋水文和海洋服务部门运营。从3米深处使用一台5马力的潜水电泵连续将港口的亚表层海水泵入。每3小时收集一次营养分析样品，装入清洁的50 cm³聚碳酸酯瓶中，并立即存放在-80°C。

浮游植物采样策略

1. 采用高频率采样（1小时间隔）模式来监测浮游植物动态。使用了Cytosense自动流式细胞仪（Cytobuoy b.v. (NL)），该设备设计用于研究0.8-800 μm之间的单个或群体浮游植物细胞。Cytosens分析了来自连续流通系统的海水，该系统以3米深处抽取，流速为1dm3/min，将样品导入中间的300cm3容器进行隔离并尽量减少分析涵盖的体积。使用重量校准的蠕动泵将样品流速设置为5 mm3/s，导入鞘液循环（经过0.2 μm过滤的NaCl溶液（35‰）），细胞在流动轴方向被分离和排列，然后被激光束（OBIS Coherent，488 nm，120 mW）检测。使用两个0.1 μm过滤器的组合不断回收鞘液。前向光散射（FWS）被收集到两个左右光电二极管上，并用于激光对准控制。侧向光散射（SWS）和荧光发射通过一组光学滤波器（SWS（488 nm），黄色荧光（FLY，506–601 nm），橙色荧光（FLO，601–650 nm）和红色荧光（FLR，> 650 nm））分离并收集到光电倍增管上。每24-72小时使用直径为3μm（Cyto-Cal?）和10μm（Polybead?）的荧光珠进行荧光和大小的校准。硅胶珠（Bangs lab?，二氧化硅微球），直径为1.0、2.02和3.13μm，用于估算浮游植物细胞的大小。

2. 根据其光散射和荧光特性对浮游植物群进行了光学分辨。对于每个样品，记录了两次连续的分析，分别设置两个不同的FLR信号（10和20 mV）触发，以优化低叶绿素含量和高叶绿素含量细胞的分析。浮游植物群落使用Cytoclus?软件进行分类。因此，每个细胞都通过一组光学脉冲形状进行表征，这构成了细胞学特征。使用不同尺寸的微球珠区分了蓝藻（光合原核生物）、微微型真核藻（picoeukaryotes）、微型浮游植物和小型浮游植物。

3. 异养原核生物的丰度分析：每隔3小时，将1.8 cm³海水亚样品立即用0.2 cm³ 20％的多聚甲醛（PFA）溶液固定，使用死亡移液管（Vives-Rego等人，2000年），并放置在4°C的黑暗中15分钟，然后在液氮-80°C存储在，直到使用CyFlow space Partec流式细胞术进行流式细胞术分析，方法见Khammeri等人（2020年）。

4. 对于picoeukaryotes和 nanoeukaryotes，根据不同尺寸的的微球进行预测量，与其等效的细胞学前向散射特征（FWS）之间的校准关系，估算细胞生物体积。对于凯伦藻等细胞，细胞大小是通过仪器中的流动成像模块生成的图像确定的。使用Cytoclus 4软件进行细胞大小测量。使用此方法处理了超过200个图像。然后建立了细胞生物体积与前向散射特征（FWS）之间的关系。对每个群体分配一个系数，将生物体积转换为碳生物量。例如凯伦藻（Lessard，1991年）和蓝细菌Synechococcus（Mackey等人，2002年）的系数分别为0.14 pg C/μm和200 fg C/cell。Picoeukaryotes 和 nanoeukaryotes碳生物量使用Verity等人（1992年）的方程计算：

Q_c,
cal = aV^0.866

Q_{c, cal}：估算的每个细胞的平均碳生物量(fg C/cell)，V：生物体积 (μm³)，“a”值不同物种不同,分别为: Synechococcus=0.39, picoeukaryotes=0.32, nanoeukaryotes=0.27, cryptophytes=0.25。

最小和最大平均细胞生物体积之间的比率已用于估计每日生长速率 (Binder等人，1996; Vaulot和Marie，1999)。这种方法假设，对于给定的群落，生长和分裂阶段是同步的：

μ_ratio = Log(V_max / V_min)

其中μ_ratio是每日生长率（d^-1），V_max和V_min分别是最大和最小的平均细胞生物体积（μm³/cell）。

表观碳生物量的增加，定义为净初级生产力（NPP），单位为mgC m³ d^-1，使用碳转换因子Q_{c, cal}与N（丰度）和指数生长率的数量积进行计算。

NPP=Q_{c, cal}×[e^μ_ratio-1]×N

结果讨论

1. 营养盐

在取样期间，温度在27-30°C之间波动，最高值出现在赤潮期的前五天，赤潮结束时下降了1.5°C（图2A）。平均盐度相对稳定，在39左右，但偶尔出现低于38.5的数值（图2B）。pH值从赤潮开始的7.85变化到结束时的8.52（图2C）。

赤潮期间，氮主要以铵的形式存在，其浓度在0.25-18.91 μM的范围内变化（图2D）。硝酸盐和亚硝酸盐的平均浓度在约2.17 μM左右波动。它们在第三和第四天显示出超过4 μM，并在第六天达到了最大值9.5 μM。磷在赤潮初期（从第1天到第3天）相对较低，然后逐渐增加，在赤潮结束时显示出最高值（4 μM）。N：P比值通常在赤潮开始阶段（从第1天到第5天）高于16，显示出潜在的磷限制，而在赤潮结束时（从第6天到第10天）低于16，表明可能存在氮限制（图4）。硅酸盐平均波动在4 μM左右，在赤潮期间相对稳定，除了第4天记录的单个高值（19 μM）。

2. 浮游植物和异养原核生物群落组成

根据材料和方法部分描述的细胞光学特性，通过流式细胞仪解析了六个浮游植物功能群（图3）。在FLR vs. FLY和FLY vs. FWS图上，区分了三个富含藻红蛋白的聚类，通过其高FLY（藻红蛋白）进行区分。识别为Synechococcus的聚类6细胞，计算的大小估计为1.77 ± 0.05 μm。聚类3和聚类4的细胞的计算大小分别为3.32 ± 0.74和14.25 ± 2.09 μm，并分别识别为类隐藻和隐藻。

Picoeukaryotes和 nanoeukaryotes细胞具有较高的FLR和低的FLY，计算的大小分别估计为2.11 ± 0.04和3.71 ± 0.22 μm。聚类1的细胞表现出最高的FLR，相对较低的FLY，计算的大小估计为31.2 ± 1.65 μm。对于聚类1收集的细胞图片，首次将其识别为Karenia selliformis（图3C）。通过16S rDNA V4序列的代谢条形码和系统发育分析，进一步证实了这一结果。在赤潮期间收集的5个样品中，真核生物群落的多样性分析显示出存在14个作为Karenia属的ASV（补充表1）。Karenia selliformis_ASV1是在监测期间检测到的最丰富的真核生物ASV，其相对丰度在赤潮期开始（第2天）和结束（第8天）之间变化，分别为45.20％至17.53％。其他Karenia ASVs的表示非常少，最大相对丰度<2％。属于八个Kareniaceae物种的18S rDNA V4区序列的系统发育树（图3D）显示，主导的K. selliformis_ASV1序列与K. selliformis CAW79（100％一致）聚类，从而确认了赤潮物种的识别为K. selliformis。

在监测期间，Karenia selliformis的贡献在聚类1中的减少也通过相机输出图像观察到（检查了200多块板），显示该物种在赤潮的前六天中占据了超过90％的微生物，而在赤潮结束时约为20％，并出现了其他微型浮游物种，如斜纹硅藻Pleurosigma sp.和一些纤毛虫。K. selliformis的丰度在监测期间波动在103至27 × 103 cell/cm³之间（图4）。在第一个监测日（2019年9月27日），Karenia selliformis的浓度在103至9 × 103个cell/cm³之间变化，这对应于赤潮的良好生长阶段（图4）。最高浓度记录在第5个监测日（2019年10月1日），这对应于春潮期。在此日期之后，浓度急剧下降，最终在监测结束时达到约（103cell/cm³），对应于退潮期，此时潮汐振幅变化小于1米。浓度的昼夜变化显示，在高潮时记录到最大值，而在低潮时记录到最小值，证明了潮汐对赤潮的控制（图4）。

Synechococcus和微型真核生物是最多的超微浮游植物群（见图5），平均浓度约为104和2 × 103cell/cm³。它们在第一个监测日展示了最高的浓度。Synechococcus的浓度在赤潮结束时急剧下降至< 102cell/cm³。类隐藻的浓度约为102cell/cm³，在赤潮结束时保持了稳定的浓度，而更大的隐藻在赤潮结束时减少。异养原核生物的浓度平均波动在2 × 106cell/cm³左右，并没有特定的变化趋势。Karenia selliformis聚类在系统中占据了超过90%的碳生物量（见图6），在第6天后，对碳生物量的贡献减少到不到80%，而纳米真核生物和隐藻的贡献增加了（见图6）。

3. Karenia selliformis的生长率和净初级生产力

Karenia selliformis细胞平均大小的昼夜变化显示出相当同步的分布，这意味着细胞的生长和分裂在时间上是分开的。大小变化呈现出明显的昼夜变化模式（见图7），与文献描述相符（Weiler和Chisholm，1976）。细胞生长始于黎明（大约上午5点），记录到的最小细胞大小约为28 μm，而细胞分裂主要发生在夜间（大约晚上7点），最大细胞大小约为33 μm。尺寸谱的分析（见图7）显示，群落在赤潮爆发期的指数阶段显示出同步分布，而在赤潮结束时非同步分布，可能是由于群落的多种构成导致较大尺寸物种的出现（见图8B）。

计算的生长速率在赤潮期的前几天显示出一般上升的趋势（见图8C），在第6天达到最大值，为0.76/d，相当于每天超过1次分裂。在赤潮衰减期间，生长速率约为0.6/d。净初级生产力（NPP）在赤潮增长阶段显示出下降趋势，第6天达到约14 mg C/m³/day的最大值，然后在赤潮结束时迅速下降至小于0.5 mg C/m³/day（第9天）。

结论

1. 建立长期监测将对赤潮爆发、生长和崩溃的条件提供非常有用的信息。如果监测站点是复发性HAB的热点地区，例如被认为加贝斯湾赤潮热点的半封闭的Boughrara泻湖（Feki-Sahnoun等，2017年；Feki-Sahnoun等，2020年），那么建立高频率监测可能会更加有效。

2. 在大尺度（每周取样）上调查的赤潮与环境变量（温度和盐度）之间的关系可能更多地表现为相关性而不是因果关系，而在更短时间尺度（1小时）上进行高分辨率观察可能更能凸显环境变量和Karenia selliformis赤潮之间的因果关系。

3. 在物种组成方面，Karenia selliformis的暴发在生长期和稳定期的最初几天几乎是单一物种，但在暴发衰退期间则趋于多样化。自动图像分类机制在提供微型浮游植物组成中各物种相对贡献的准确估计方面会更加有用（Campbell等人，2010）。Feki-Sahnoun等人（2020）使用朴素贝叶斯分类器模型框架分析了Karenia selliformis暴发期间和之后的物种组成，得出了不同的结论，显示Karenia selliformis在暴发期间与一些裸藻和甲藻相关。这种差异可能源于所涉及调查的时间尺度不同。在每周监测中被认为是暴发的现象在高频率调查中可能对应于暴发结束，因此可能反映出类似的多种物种组成，而暴发在其开始时是单一物种的。

4. Karenia selliformis的生长速率和产量对生物量积累的影响。Karenia selliformis像大多数甲藻一样，复制非常缓慢，每天的分裂少于1次（Brand等，2012）。在暴发期间测得的生长速率证实了这一说法，在暴发生长期和稳定期内，每天的分裂次数几乎不到一次（<0.69 d?1），第6天的分裂次数超过一次，暴发结束时接近每天一次分裂（图8）。问题在于Karenia selliformis如何在相对较低的生长速率下实现这种生物量积累。有人可能会质疑基于最大和最小平均生物体积比率的生长速率估计。这种简单的方法假设细胞的生长和分裂是分时进行的（同步群体），而实际上这些过程在群体中是同时发生的（Waterbury等，1986；Binder和Chisholm，1995；Jacquet等，2001）。使用Sosik等人（2003）描述的大小结构化种群模型对整个整合期内的细胞生长和分裂进行建模，更能代表非同步群体（Dugenne等，2014；Marrec等，2018），并导致高于中位数尺寸比率的生长速率估计μratio = ln(vmax/vmin)（Marrec等，2018）。在最大生物量期内，由于尺寸谱的分解（图7），生长速率估计受这种限制的影响较小，显示出在暴发高峰期的分布相当紧凑，这主要受光/暗周期的控制（Ralston等，2007），而在暴发结束时尺寸分布更为分散（图7）。

总结

基于流式细胞术结合图像处理的浮游植物细胞尺寸的昼夜变化代表了一种有趣的技术，用于在高频调查期间计算自然浮游植物群体的生长速率。此外，利用这种技术监测有害藻华非常有用，因为它可以识别赤潮物种及其在种群和内在水平上的动态。

研究指出，Karenia selliformis的丰度与营养成分之间存在高度相关性，暴发生长期可能受到磷（P）的限制，暴发结束时则可能受到氮（N）的限制。由于生态系统中特别富含有机物质和异养原核生物，Karenia selliformis的混合营养行为也不能被排除。

在监测的最初几天，Karenia selliformis几乎表现为单一物种的暴发。计算的生长速率总体显示较低值（<1次分裂/天），因此不足以解释积累的生物量。潮汐动态似乎在爆发浓度中起到了主要作用。确定物理运输和净生长对某一地区物种积累的贡献是值得研究的。

—— 原文 ——

Boudriga I, Abdennadher M, Khammeri Y, et al. Karenia selliformis bloom dynamics and growth rate estimation in the Sfax harbour (Tunisia), by using automated flow cytometry equipped with image in flow, during autumn 2019[J]. Harmful Algae, 2023, 121: 102366.

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