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创新2024 | 洞悉生命奥秘 类器官成像详解(方案和试剂篇)
发布:赛默飞世尔科技生命科学产品浏览次数:1在神经生物学,干细胞研究,再生医学和癌症生物学中,类器官和球状体模型的使用频率越来越高。这些3D模型内的细胞相互作用、细胞分裂、形态学,以及基因和蛋白表达等方面更接近体内真实情况,更准确地模拟了细胞的自然环境,进而实验结果的生理相关性更高。2D和3D细胞模型的对比请见下表:
表1. 2D和3D细胞模型的对比
3D培养的细胞、类器官和球状体需要特殊样品处理和染色方法,才能使用荧光显微镜进行观察。相对于2D培养的细胞来说,3D培养细胞有一定厚度,导致光无法有效透过。使用成像法观察固定3D细胞模型(包括类器官和球状体)时,建议使用透明化试剂处理样品,以获得清晰明亮的荧光图像。
图1. 透明化处理可显著改进球状体荧光染色结果(A549球状体)。
细胞核:Hoechst,蓝色,货号H21486;增殖:AF488-EdU,绿色,货号C10337;AF647-Ki67,紫红色。
试剂和耗材
图 2. HeLa 球状体缺氧内核检测。
缺氧:Image-iT 缺氧检测试剂(红色,货号H10498);复染:NucBlue Live ReadyProbes 试剂(蓝色,货号R37605)。
实验步骤
小贴士
我们建议您减掉移液管尖端、扩大开口,以保护球状体结构。
本方案建议用于厚度在500微米以内的球状体。
阅读荧光染料和试剂的说明书:并非所有的染料和试剂都可以固定,许多染料和试剂需要在固定前使用。
我们强烈建议您在使用透明化试剂盒之前优化好一抗浓度:用梯度稀释的抗体染色阳性和阴性对照样品,稀释倍数包括1:10、1:100、1:500、1:1000;较厚的球状体可能需要更多的抗体。
球状体固定和透明化
(上下滑动,查看3D成像详细实验步骤)
类器官功能检测常用试剂
细胞活力检测
推荐使用 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性试剂盒(货号 L3224)。固定前进行下列步骤。
将 5 μL 组分 A 和 20 μL 组分 B加到 10 mL DPBS 中,以制备染色溶液。
将 100–200 μL 染色溶液直接添加到细胞中。
室温避光孵育 2 小时,保持轻柔震荡。
活球状体细胞活性氧 (ROS) 检测
推荐使用 CellROX Green 试剂(货号 C10444) 在固定前进行活性氧检测。只有 CellROX Green 和 Deep Red 可以固定和透化。
小贴士:使用100 μM 甲萘醌处理后的球状体作为阳性对照。
将 CellROX Green 染料添加到培养基中,终浓度为 5 μM(例如,每 500 μl 培养基添加 1 μl)。
室温避光孵育 2 小时,保持轻柔震荡。
用 PBS 清洗。500 g 离心 5 分钟。轻轻除去上清液。重复 3 次。
固定。后续可进行抗体染色和 NucBlue Live ReadyProbes 试剂(货号 R37605)复染。
图4. 检测药物处理的 HeLa 球状体中的细胞活力和氧化应激。
A–C:在使用Live/Dead细胞成像试剂盒(货号R37601)检测的球状体中,活细胞发出绿色荧光,死细胞发出红色荧光。D–F:在用 CellROX Deep Red 试剂(货号C10422)和 NucBlue Live ReadyProbes 试剂(货号R37605)染色的球状体中,氧化应激的细胞发出红色荧光,而活细胞细胞核发出蓝色荧光。
细胞凋亡检测
注意:固定前进行下列操作。仅 CellEvent Caspase 3/7 Green 和 Red可固定。
在样品中加入CellEvent Caspase 3/7 检测试剂,终浓度2 μM;每 mL 样品中加 1 滴 NucBlue进行细胞核复染。
室温避光孵育 2 小时,保持轻柔震荡。
用 PBS 清洗。500 g 离心 5 分钟。轻轻除去上清液。
固定等后续操作。
图5. 乳腺癌球状体中的 NK 细胞 ADCC 检测(抗体介导细胞毒性实验)。
细胞示踪:CellTracker Deep Red,紫红色,货号 C34565;凋亡:CellEvent Caspase 3/7 Green,绿色,货号C10423;细胞核:NucBlue Live,蓝色,货号R37605。
细胞增殖检测
(上下滑动,查看3D成像详细实验步骤)
热门类器官功能检测试剂
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2024-07-23相关仪器 -
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