想暑假逆袭拿data？简单几招让细胞实验开启2倍速

有什么提高目标细胞纯度的建议吗？

以下是使用 Dynabeads 磁珠进行阴性分离时提高目标细胞纯度的一些建议：

• 良好的回收率和纯度取决于含有少量粒细胞和血小板的高质量MNC制备。

• 在混合步骤中可以使用Invitrogen?  HulaMixer? 样品混匀器（货号 15920D），确保抗体与目标细胞充分结合。

• 在抗体结合步骤后充分清洗细胞，以去除未结合的抗体。

• 2次重复方案可在不增加分离中使用的 Dynabeads? 磁珠数量的情况下提高纯度。

能否提供一些提高最终回收率/产量的建议？

以下是使用 Dynabeads 磁珠进行阴性分离时提高最终回收率/产量的一些建议：

• 样品制备：所有分离都必须在单细胞悬浮液中进行。

• 确保使用正确的细胞数、稀释度以及抗体混合物、Dynabeads? 磁珠和缓冲液的体积。

• 在混合步骤中可以使用 Invitrogen? HulaMixer? 样品混匀器（货号15920D），以确保分离过程中的充分混合。

• 在最后一个步骤中，细胞/磁珠颗粒在放置到磁力架上之前必须用 1 mL 移液管充分重悬 >10 次。这样做是为了捕获可能被困在细胞团中的目标细胞。

• 用于制作分离和洗涤缓冲液的 PBS 应不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺，以避免补体活化和细胞聚集。

在使用 Dynabeads 磁珠进行单核细胞阴性分离时，发现了聚集现象。该怎么办？

在分离单核细胞时，活化的血小板会与单核细胞结合，产生不利的单核细胞和血小板聚集。引发血小板活化的因素有多种，如温度变化、机械因素（如剪切力）、接触抗凝剂肝素（通常存在于采样管中）等。为避免血小板活化（以及随后的单核细胞聚集），应遵循以下几项一般建议：

• 使用肝素以外的抗凝剂（如 ACD、EDTA 或柠檬酸钠）。

• 在制备 MNC 之前，血液样本应保存在室温下，MNC 制备本身也应在室温下进行。

• 样本处理时应轻柔，尽量减少机械剪切。如果可能，应使用注射器/针头手动抽血，而不是 Vacutainer? 管，因为这种采样管中的真空往往会导致血小板和单核细胞活化。

• 众所周知，柠檬酸钠能 "稳定 "血小板并防止活化，除了作为抗凝剂的缓冲柠檬酸盐溶液外，柠檬酸钠还含有茶碱、腺苷和双嘧达莫。

• 请遵循我们的 MNC 制备方案，因为该方案旨在获得血小板数量较少的 MNC。

DETACHaBEAD? 磁珠溶液看起来浑浊，这正常吗？

浑浊是 DETACHaBEAD? 磁珠的正常现象，因为蛋白质含量很高，蛋白质会沉淀。这并非细菌污染，不会影响分离和释放细胞的回收或活力。使用前请彻底混合溶液。

能否提供使用 DETACHaBEAD? 磁珠时提高细胞产量的技巧？

这里有一些建议：

• 使用前充分混合 DETACHaBEAD? 溶液。

• 孵育步骤中磁珠与样品的混合是获得高产量的关键参数。我们建议使用混合器或旋转器（如 HulaMixer? 样品混合器（货号 15920D）），使试管持续运动，但要使样品停留在试管底部，以避免珠子干燥。

• 在细胞分离过程中缩短孵育时间（较低的结合亲和力可提高释放效率）。

• 用 DETACHaBEAD? 磁珠孵育后，在使用磁力架之前，用移液管上下吹打与磁珠结合的细胞至少 10 次，以尽可能多地将磁珠从细胞上移除。过于用力的移液会降低细胞存活率。

• 在操作过程中避免不必要的延迟。

使用任何 Dynabeads 阳性分离试剂盒分离细胞时，如何提高细胞产量？

以下是一些建议：

• 样品制备非常重要。所有分离都必须在单细胞悬浮液中进行。对于直接从全血中分离某些类型的细胞（如单核细胞），建议您在分离前清洗血液，以去除样品中的干扰因素。

• 所有指定 "混合 "的孵育都必须使用适当的混合器。可使用任何可倾斜旋转或端端混合的混合器（如 HulaMixer? 样品混匀器（货号 15920D））。

• 如果使用 FlowComp? 试剂盒，先在细胞中加入抗体，然后再加入磁珠（间接法），则应在加入磁珠前通过洗涤去除多余的抗体。

• 使用释放剂孵育后，建议使用 1 mL 移液管吹打 >10 次，重新悬浮样品，然后再将样品放置在磁力架上。

• 细胞分离必须使用推荐的分离缓冲液。PBS 必须不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺，因为这些二价离子会导致补体激活和细胞聚集。

• 样本中的细胞聚集会严重降低分离的产量和纯度。

能否提供一些提高 Dynabeads? FlowComp? 细胞分离试剂盒释放效率的建议？

以下是一些建议：

• 由于 DSB-X 生物素-链霉亲和素键会随着时间的推移而变强，因此释放步骤的时间不要超过方案中规定的时间。在某些情况下，缩短孵育时间可提高产量。

• 使用释放剂孵育后，建议使用 1 mL 移液管吹打>10 次，重新悬浮样品，然后再将样品放置在磁力架上。

如果找不到适合的细胞类型的 Dynabeads 阳性分离试剂盒，该怎么办？

推荐将 Dynabeads? FlowComp? Flexi 试剂盒与合适的目标抗体结合使用，进行细胞分离。Flexi 试剂盒包含用于抗体生物素化的 DSB-X 生物素化试剂盒、经修饰的链霉亲和素包被的 FlowComp? Dynabeads? 磁珠以及进行分离和释放所需的 FlowComp? 释放缓冲液。

能否提供一些改进 CELLection? 释放步骤的小技巧？

以下是一些建议：

• 确保 RPMI + 1% FBS 的 pH 值不要太高：DNase I 在 pH 7.0-7.4 之间效果最佳（RPMI 中的氧气会导致 pH 值升高，pH 指示器会变蓝）。

• 在 DNase I 处理过程中，不要使用 RPMI + 10% FCS。10% FBS 的细胞产量比1% FBS的细胞产量低（可能是由于某些批次的 FBS 中含有抑制 DNase I 的因子）。

• 确保缓冲液中含有 DNase 活性所需的 Mg²⁺/Ca²⁺ 。

• 必须温和处理 DNase I。剧烈搅拌 DNase 溶液会降低酶的活性。切勿搅动 DNA 酶溶液。

• 分选少量细胞时，建议使用 RPMI + 10% FBS 预涂试管，以减少细胞丢失（细胞有粘性，在分选过程中容易附着在管壁上）。

• DNase I 在 20°C 时有很好的活性，建议在开始 DNase I 处理前将 RPMI + 1 %FBS 预热到 37°C，因为不同实验室的 "室温 "不同。

• 用 DNase 释放缓冲液培养细胞后，必须在磁分离前用移液管彻底吸出磁珠-细胞复合物，以便对 DNA 连接体进行机械破坏。如果不对细胞进行移液，将影响细胞产量。

在使用 CELLection? 生物素结合剂试剂盒或 CELLection? Pan Mouse IgG 试剂盒时，能否提供一些提高产量的建议？

以下是一些建议：

• 包被 CELLection? Dynabeads? 磁珠时，滴定/优化目标抗体量。

• 如果目标细胞数量少或细胞表面的目标抗原浓度低，请使用间接法。

• 每毫升样本（>25 μL）一定要使用 >1 x 10⁷ 磁珠。

• 使用前清洗全血。

• 为确保最有效地释放细胞，重新悬浮冻干 DNase 时切勿涡旋 DNase。

• 细胞释放时，使用预热至 37°C 的新鲜 RPMI/1% FCS。

• 检查 RPMI 的 pH 值。应为 7.0-7.4。较高的 pH 值会抑制 DNase 的活性。

• RPMI 应含有足够的 Mg²⁺ 以保证 DNase 的活性。

• 用 DNase 释放缓冲液孵育细胞后，必须在磁分离前用移液管彻底吸出磁珠-细胞复合物，以便对 DNA 连接体进行机械破坏。如果不对细胞进行移液，将影响细胞产量。

在扩增T 细胞时，细胞在使用 Dynabeads? 磁珠激活后死亡？这是为什么？

这里有几个保持最佳细胞培养生长条件的小窍门：

• 细胞密度必须保持在 0.5-1.5 x 10⁶ 细胞/mL ，以获得最佳生长状态。当细胞密度超过 1.5-2.5 x 10⁶ 细胞/mL 时，需要重新刺激。

• 每隔 8-12 天重新刺激一次，磁珠与细胞的比例请参照产品手册。

• 根据产品手册，针对每种特定产品使用正确的磁珠与细胞比率进行活化。过多的磁珠会抑制细胞活化/增殖。

• 使用优化的细胞培养基，添加

  - 生长因子（IL-2、IL-7、IL-15 或其他细胞因子）

  - 促进生长的补充剂（如人血清/FBS、L-谷氨酰胺/谷氨酰胺、自由基清除剂（10 mM N-乙酰半胱氨酸）