收藏！干细胞无饲养层培养必备干货，一次性掌握~

干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的细胞，能够分化成各种类型的细胞，如神经细胞、心肌细胞、血细胞等。因此，干细胞在再生医学、疾病模型构建和药物筛选等领域具有广泛的应用前景。

细胞培养的成功取决于许多因素，包括使用的细胞和试剂的质量，无菌操作以及实验室设备。

细胞培养实验室的基本设备包括生物安全柜、37℃ 5%C02培养箱、水浴锅、离心机、自动细胞计数板、显微镜等。所有需要用到的耗材均需保证无菌且在安全柜内开封。生物安全柜可以提供通风无菌的操作环境，培养箱提供恒温、恒定适度以及适当气体交换的培养环境。全自动细胞计数仪可以帮助快速、准确的细胞计数。

? 实验前需要提前用含1%浓度matrigel培养基混合液包被六孔板，放于37℃ 5%C02培养箱1h以上。

? 细胞解冻前预先将培养基复温到室温（注意部分培养基不可以于37℃水浴锅加热）。

? 设置水浴锅温度为37℃，从液氮罐中取出需要复苏的细胞并快速放至水浴锅中轻微十字摇晃，确保冻存管内液体均匀受热。在观察到冻存管内只剩下小冰晶时，可转移到生物安全柜内进行下一步操作。

? 用1ml枪头吸取已复温的培养基加入冻存管中，轻微吹打混合均匀，转移至离心管中，再另取1-2ml培养基冲洗冻存管并转移至离心管中，确保冻存管中无细胞残留。

? 25℃，1200rpm，5min离心。

? 弃上清液，加入含有终浓度为10μm 的Y-276321培养基重悬，轻柔吹打。根据细胞密度接种到六孔板中，十字摇晃确保细胞均匀分布在板内。

? 24h后要及时换成不含Y-27632的培养基。这里值得注意的是，Y-27632的适时使用会增加干细胞的活率，促进增殖，但使用时间不宜超过24h，过长的时间会导致细胞分化。

? 培养过程中需要每1-2天进行换液，每天都需镜下观察细胞生长状况。

? 当细胞汇合度达到70%，就可以传代了。先于显微镜下4倍镜观察，在皿底部标记分化区域以便在生物柜中用移液枪吸取或墙头轻微刮拭去除分化部分。

? 在生物柜中，吸除培养基，加入细胞传代试剂（如 ReLeSR(TM)）,确认液体覆盖细胞表面后，吸除。将培养板放在37℃ 5%C02培养箱孵育5min（不同类型的细胞系和消化试剂所需时间不同，可于镜下观察确认最佳消化时间）。

? 轻微震荡培养板，观察到细胞团脱落，用1ml枪头转移至15ml离心管，注意动作轻柔，避免外力刺激细胞分化。

? 用移液枪轻轻、缓慢吹打细胞悬液，使大团块分解，但避免过量吹打生成单细胞悬液。

? 轻晃离心管确保细胞悬液均一，吸取10μl细胞悬液，转移至细胞计数板，静止30s，上机。

? 实验室使用的是瑞沃德家的自动细胞计数仪，相较于之前使用过的某品牌计数仪，瑞沃德的这款在自动聚焦、曝光的基础上，更新了面板控制手动调节焦面和曝光值，并可以针对想要聚焦的区域进行放大观察，极大地提高了计数的准确性和效率。每次传代，我们都会使用自动细胞计数仪进行细胞计数，以确保接种密度的准确。

? 吸除包被的六孔板中marigel稀释液，加入含有10 μM Y-27632的培养基。根据细胞密度计算，确保3-4×10^个细胞/孔接种。加入培养基后，进行∞摇晃，确保细胞均匀分布在孔内。放入37℃ 5%C02培养箱培养，隔天换液。

Y-27632的使用可以显著提高干细胞的存活率和增殖能力，但使用时间不宜超过24小时。此外，自动细胞计数仪的引入极大地提高了我们实验的效率和准确性，减少了人为操作带来的误差。

通过这篇文章，希望能够为大家在干细胞培养方面提供一些实用的经验和建议，同时也展示了高效设备在实验中的重要性。期待在未来的研究中，能够与更多的科研人员交流合作，共同推动干细胞技术的发展。

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