一、样品提取 

样品称取脱脂： 称取均质后的待测样品 2.00 g( 精确到 0.01 g)，置于 50  mL 离心管中加入 10 mL 甲醇 / 水混合物 (2:1, v/v)，振 荡混匀 10 min，4000 r/min 离心 10 min，吸取清液弃掉， 离心管中试样备用。 

水解衍生化： 向上述离心管中加入 20 mL 0.2 mol/L 盐酸，振荡混匀 10  min，后加入 0.4 mL 0.05 mol/L 2- 硝基苯甲醛 (0.075 g 2- 硝基苯甲醛溶于 10 mL 二甲亚砜 )，涡旋混匀 1 min，置于 37℃恒温振荡器水浴中避光反应 16 h。将上述衍生液，放置 至室温，加入 5 mL 0.1 mol/L 磷酸氢二钾溶液，用 1 mol/L  NaOH 调节 pH 到约 7.4，4000 r/min 离心 10 min，上清液 ( 对 脂肪含量多的试样，可加入 5 mL 正己烷，振荡 2 min，4000  r/min 离心 5 min 吸取并弃掉正己烷 ) 待净化。 

二、SPE 柱净化（Copure® HLB，60 mg/3 mL） 

活化：依次用 5 mL 甲醇、10 mL 水活化。 

上样和洗脱：取上述备用液控制流速小于 2 mL/min 过柱。待 样液全部通过后用 10 mL 水淋洗上样柱，弃去全部流出液并真 空抽干，Z后用 5 mL 乙酸乙酯洗脱柱子上的待测成分。 

重新溶解：收集洗脱液，于 40℃氮气吹干，准确加入 1 mL 乙腈 / 水溶液 (1:2, v/v) 溶液溶解残余物混匀，0.22 µm 滤 膜过滤，供高效液相色谱测定。

三、仪器条件 

设备：Waters Alliance 2695 色谱柱：XB-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 µm) 检测器：Waters 2487 紫外检测器 检测波长：275 nm 流动相：A：乙腈   B：0.01 mol/L乙酸铵（0.77 g乙酸铵用水定容至 1 L， 甲酸调 pH=3.5） 洗脱方式：梯度洗脱，见表 1 

表 1 流动相梯度洗脱程序