【黑科技】Hypercarb联合Vanquish Core精准测定dNTPs及杂质，助力分析进展加速

dNTP是deoxy-ribonucleoside triphosphate（脱氧核糖核苷三磷酸）的缩写，是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C等中的一种。在生物DNA合成中，以及各种PCR（RT-PCR（reverse transcription PCR）、Real-time PCR）中起原料作用。这些化合物属于大极性化合物，常规的反相色谱柱通常难以保留，而使用离子对试剂，方法的耐用性会受到挑战。

仪器：Vanquish Core HPLC

色谱柱：Hypercarb，150 x 2.1 mm，3 μm（P/N 35003-152130）

流动相：A：己胺 (5mM) ，加入DEA (0.4%, v/v), 用冰醋酸调pH=10   B: 乙腈

流 速：0.3 mL/min

柱 温：30 ℃

进样量：5 μL

检测波长：UV 254/272 nm

具体梯度条件参见 AN_24053_CCS

dNTPs是包含核苷和三磷酸基团的大极性化合物，如使用反相色谱柱，流动相添加离子对试剂是比较复杂的方法，同时不利于色谱柱寿命；在此之前，基于Hypercarb色谱柱耐受宽pH值（1-14）的特点， Hypercarb已成功应用于碱性条件下分析核苷酸和阿糖胞苷类化合物等含有单磷酸或者多磷酸基团的大极性化合物^[1]，此方案同样考虑在碱性条件下保留和分离dNTPs。

参考阿糖胞苷测试方法，流动相A为己胺 (5mM) ，加入DEA (0.4%, v/v), 用冰醋酸调pH=10，流动相B为乙腈。图1展示了优化后梯度下的4种化合物单标定位谱图。  

图1. 4种dNTP化合物单标定位谱图

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图2展示了dNTP 4种化合物重复性谱图，连续6针，4种化合物保留时间和峰面积RSD均小于1%。

图2. dNTP 4种化合物重复性谱图（n=6）

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在不同波长下分析dNTP 4种化合物，如图3所示，浓度均为50μM ，dCTP和dTTP在波长为272nm时响应更高，而dGTP和dATP在波长为254nm时响应更高，可根据实验的需求选择更合适的波长进行分析。

图3. 不同波长下dNTP 4种化合物响应谱图

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当dCTP浓度为2.5 mM时,通过优化水相起始比例和梯度方法， dCTP和相关杂质均可以分离，峰型较好。对dCTP及相关杂质在Hypercarb色谱柱上保留和分离的重复性进行了研究，如图4所示，连续3针进样，重复性表现优异，保留时间和峰面积RSD＜1%。图5展示了不同波长下dCTP及相关杂质响应谱图，可以看到272nm下，二磷酸杂质和dCTP主峰响应更高。

Hypercarb色谱柱使用方法和反相色谱柱类似，但是由于其特殊的保留机理，流动相添加剂和污染物容易吸附在石墨化碳表面，需要及时对色谱柱进行清洗。本方案中，最高有机相比例为30%，需要定期使用高有机相冲洗色谱柱，一般建议80%乙腈冲洗20个柱体积以上。如果长时间使用后污染较为严重，可以反接色谱柱，使用纯乙腈低流速75℃柱温下冲洗120个柱体积以上^[2]。

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