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解决方案
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基于沉淀酶解法的IgG-1类型单克隆抗体药物临床前生物分析的通用方法
发布:赛默飞色谱与质谱中国浏览次数:1142【概述】
对于ZL单抗药物建立一个通用的生物分析方法对于制药工作者来说具有非常大的意义,尤其对于在药物的早期研发阶段进行筛选时。介于目前在各药企研发管线上的在研单抗药物大多是全人源化的,这为在临床前阶段实现单抗药物生物分析的通用方法提供了可行性。通过选择人源化抗体恒定区的通用肽段,我们可以在非人源的生物基质中实现特异性的
检测人源化抗体。在样品前处理方面,直接酶解法和免疫富集酶解法在不同的实验需求下被使用。免疫富集酶解法,即
亲和质谱法可以提供低至10ng/mL级的定量下限[6, 7],但是亲和质谱法一般只适用于血清(血浆)样本,且对抗药抗体并不能完全容忍。在这篇工作中,我们使用去垢剂辅助的沉淀酶解法(surfactant-aided precipitation/on-pellet-digestion,SOD)来进行样品前处理。
【实验/设备条件】
样品前处理主要试剂耗材
SILuTMMab K1 - Stable Isotope Labeled Universal Monoclonal
Antibody Standard (SigmaAldrich, P/N: MSQC6)
Sequencing Grade Modied Trypsin (Promega, P/N: V5117)
DL-Dithiothreitol (SigmaAldrich, P/N: D9163)
Iodoacetamide (SigmaAldrich, P/N: I6125)
【样品提取】
样品前处理步骤
● 内标掺入: 取1mg总蛋白含量所对应的血清样品(或者标准曲线),加入10L 内标工作液, 随后加入合适体积的
PBS溶液,使得终体积为80L。不同动物血清总蛋白含量有一定差别,对于大鼠来说对应为20L 血清,加入10L 内标工作液和50L PBS溶液。稀释后的样品总蛋白浓度为12.5 g/L, SILumAb K1内标蛋白对应血清原始浓度为10 g/mL。
● 蛋白变性/还原烷基化: 取16L 稀释后的样品(含有200g 总蛋白), 加入84L 1.2% SDS的PBS溶液,PBS溶液的pH值为8.0。加入2L 500 mM DTT溶液 (DTT的终浓度为10 mM), 56°C还原30分钟,随后冷却至室温。加入6.5L 500 mM IAA溶液 (IAA的终浓度为30 mM), 室温暗处反应30分钟。
● 蛋白沉淀: 加入1倍体积预冷丙酮(108 L), 溶液出现浑浊。随后再加入5倍体积预冷丙酮(540 L), 剧烈震荡,随后-20度放置3小时(或者过夜)。12,000 g 4度离心20分钟,移去上清。加入600 L 预冷acetone : H2O= 6 : 1溶液,剧烈震荡, 随后12,000g 4度离心20分钟,移去上清,室温干燥10 min。
● 目标单抗酶解: 加入120 L 50mM Tris/HCl 溶液 (pH 8.2),加入32 L胰酶溶液(胰酶溶液的浓度为0.25 g/L, 用
10mM 醋酸溶解),37度600rpm震荡酶解90分钟,沉淀可以全部溶解。
● 酶解终止: 12,000 g离心2 min, 取出135 L上清,加入15L 10% FA/50% ACN以完全终止酶解反应。随后进样20-
50 L样品用于LC-MS/MS检测。
【实验/操作方法】
1. 使用三重四级杆质谱进行蛋白药物定量的方法开发流程
使用质谱进行蛋白药物定量,在方法开发时主要考虑样品前处理和质谱方法两个主要方面。在前处理方面我们使用了去垢剂辅助沉淀酶解的方法来获得更佳的酶解效率和更低的基质效应,具体步骤如图1a所示。蛋白类药物质谱定量时一般采用bottom-up的策略,因此整个质谱方法的开发主要包括候选肽段挑选,质谱参数优化(Compound Optimization)和离子对精简(Renement)三个步骤(图1b)。
● 候选肽段挑选
一般来说,我们挑选的候选肽段需要满足以下条件: (1) 该肽段在基质样品不存在完全相同的序列,在实际工作中,这一步通常需要放到ZH的renement步骤完成评估。(2) 肽段的长度在7-20个氨基酸为宜, 太短的肽段特异性较差,而太长的肽段通常色谱质谱行为不佳,给方法开发带来困难。(3) 没有漏切位点。(4) 不含M, C, KP/RP, HxS/T等氨基酸或者一致序列。(5) 该肽段质谱响应高。由于三重四级杆质谱仪不具备数据依赖采集(Data-dependent Acquisition, DDA)的功能来对蛋白药物进行肽图分析,因此在进行候选肽段挑选时通常依赖于软件预测的方法[8]。然而软件预测通常效率不可控,因此通常需要产生较多的候选肽段来进行后续的化合物优化和renement步骤,从而增加了方法开发的时间。
而在实验室拥有高分辨质谱的情况下,我们可以大大简化这一步骤。我们将目标单抗掺入BSA基质进行酶解,随后采用Orbitrap质谱仪进行DDA的数据采集,生成的数据使用Proteome
DiscovererTM (PD) 2.3进行非标记定量(Label Free Quanti_cation, LFQ)分析,可以轻松的找到强度高的肽段(图1b)。随后我们仅需选出不含漏切位点,不含M, C, KP/RP, HxS/T且长度合适的肽段即可。采用Orbitrap进行LFQ分析后,我们不仅可以获得肽段的强度信息(图2a, 2b),还可以获得每条肽段的注释二级谱,帮助我们在挑选离子对时排除掉一些诸如中性丢失等选择性差的离子对(图2c)。
为了帮助我们在定量单抗药物时更好的监控药物在体内的结构完整性,我们在单抗恒定区的四个主要结构域均挑选了2-3条候选肽段来进行后面的优化和精选(图3)。LSP2,HSP2和HSP8三条候选肽段均含有半胱氨酸残基(图3b,3c),在IAA处理后会形成烷基化的固定修饰,理论上不适合作为定量肽段,但为了保证每个结构域均有肽段能够参与定量,我们依旧在优化和精选步骤将中它们计入考察。
【实验结果/结论】
我们借助于TSQ Altis的高灵敏度建立了一种基于沉淀酶解法的IgG-1类型单抗药物临床前生物分析的通用方法。该方法操作简单,价格低廉且具有高度通用性,可使用于临床前动物模型的所有生物基质。此外该方法还可以在测量体内药物浓度的同时监控单抗大分子药物的结构完整性。该方法广泛适用于药物开发的早期筛选以及药物的临床前研究阶段,提供注册必需的药代和药效动力学以及吸收/分布/代谢/排泄数据。该方法可为广大药企和CRO公司节约大量的方法开发时间, 并提供更多维的信息帮助制药工作者在早期判断候选抗体的成药可能性。
2021-08-18相关仪器 -
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