【荧光测量】典型配置、硬件说明、软件操作

典型的荧光测量系统配置，包括：光谱仪操作软件、光谱仪、计算机、光源、光纤、比色皿和支架。比色皿支架采用四通道的CUV-ALL-UV 型，该支架既可以用来测吸光度，又可以用来测量荧光。为客户只需要将光纤和比色皿支架的连接位置进行更改， 即可实现两种不同的测量。吸光度测量时，在 180°位置的两个通道中使用 74-UV 准直镜， 通过SMA 905 接口连接两根光纤；而荧光测量时，在 90°位置的两个通道中使用 74-UV 准直镜，此外，荧光的光纤接收端的对面位置还可以添加74-MSP 反射镜，从而增强接收到的荧光信号。

图1 荧光测量系统典型配置图

表1 典型系统配置▼

光源的基本操作步骤：

• 启动光源，预热 10 分钟，以达到稳定状态；

• 光纤与光源连接后，可通过转动调节光阑旋钮控制光强；

• 如果用户在实验操作中对光源的输出光谱有特殊要求，可在插片凹槽处放置滤光片、衰减片等光学器件。

【LLS 系列光源介绍】

表2 LLS系列光源规格▼

图7 CUV-ALL-UV 4-WAY 比色皿支架

图8 CUV-FL-DA 直连比色皿支架

下面我们以CUV-ALL-UV 4-WAY 比色皿支架为例，介绍比色皿支架的使用方法。

• 将比色皿放置在CUV-ALL-UV 4-WAY 比色皿支架的夹具中，支架内配有可调弹簧活塞，用来固定比色皿。比色皿支架有一个内置的滤光片插槽，我们将连接光源的光纤引入靠近插槽一侧的连接口。可将滤光片放置于插槽中，进行吸光度测量。
• 两根光纤连接比色皿支架时，若两端呈现 90°，则用于测量样品的荧光；若两端呈 180°，则用于测量样品的吸光度。可根据具体要求连接光纤与比色皿支架。
• 比色皿支架的底部有隐藏管道，可连接外部水源，以控制比色皿内样品温度。如下面实物图所示，支架底座可见 3 个出/入水口，出/入水口前的白色旋钮可拆卸，使用时请根据需求卸下。将通道口连接附件，附件的另一侧连接水管，用户可选择两进一出或两出一进模式。需要注意的是，用户需要将将出水口管道一侧接入水泵。

图10  CUV-ALL-UV 4-WAY 比色皿支架实物图

图11 连接附件

搭建荧光测量系统，具体操作步骤如下：

1）使用一根光纤连接比色皿支架与光谱仪，另一根光纤连接比色皿支架与光源，注意两端光纤呈 180°（如图 所示）；

2） 通过USB 数据线连接光谱仪至PC 端；

3）用电源线连接光源和市电插座（注意选择带地线的国标电源线和市电插座）；

4）打开光源，预热一段时间后，在空比色皿中装入纯水，测量参考光谱；

5）切断光路（此处不建议直接关闭光源，可通过遮挡光源来切断光路），测量背景光谱；

6）恢复光路，将样品装入空比色皿，进行样品的吸光度测量。

【荧光测量光谱仪的选择】 

本部分介绍荧光测量的软件操作流程，具体操作步骤如下：

1）从欢迎界面或者点击图标创建新的光谱应用，在光谱应用向导中点击吸光度向导图标。

• 活动采集：在当前光谱仪的基础上建立该应用。

• 新建采集：为新建应用创建或选择光谱仪数据源。

3）调整好硬件配置后，在软件中设置数据采集参数，包括积分时间(integration time)、平均次数(average)和滑动平均(boxcar)。用户可根据光源的强度，调节积分时间和平均次数等参数，勾选 “暗噪声校准”和“非线性校准”功能。注意参考 谱测量和样品测量时的参数设置应相同。设置完成，光谱将显示在右侧谱图界 面，点击“下一步”按钮。 

• 积分时间：积分时间是检测器在将累积的电荷通过A/D转换器加工之前，被允许收集光子的时间长度。最小积分时间是设备支持的最短积分时间，它取决于检测器读出所有像素信息的快慢，积分时间 与数据传输速度是不同的概念。

• 平均次数：光谱被显示到软件里之前会采集多次，然后取平均。

• 滑动平均：平滑是一种可以应用于光谱的空间平均。该过程通过平均相邻像素点的值来消除噪声，因此它会以牺牲光学分辨率为代价来提高信噪比。空间平均在光谱相对平坦以及相近像元变化较小的情 况下使用是非常有效的，但由此产生是分辨率的损失会使得尖锐的光谱特征峰难以分辨。当应用空间 平均时，信噪比会以像元平均的平方根为基数进行提高。请注意，在海洋光学软件中，平滑宽度的值 是指所有像元以中间为基准靠左或靠右的像元和的平均数。平滑值是4实际上是将9个像元一起平均（4个靠左像元+1个中心像元+4个靠右像元），信噪比将以3为倍数增加。同样的，平滑值是2（5个 像元）将使信噪比以2.2为倍数增加，平滑值是0（1个像元），信噪比以1为倍数增加（因此光谱不改 变）。

• 暗噪声校准：海洋光学的大部分光谱仪都有自带的遮光像元。暗噪声校准会用当前光谱读数减去遮光 像元的读书，以排除温飘等系统性影响。

• 非线性校准：光谱仪出厂前已完成。如无特殊需求，请默认勾选。

• 触发模式：请参考海洋网站的相关文档。如无特殊需求，可保持默认设置不变。 

4）出现“保存背景光谱”窗口，点击图标按钮，保存背景光谱。之后点击“完成”按钮完成设置。

5）在视图窗口中，荧光测量结果如下图所示。左侧为数据流图窗口，右侧为光谱全 谱，图谱结果实时更新。谱图中，激发光谱和荧光光谱同时显示，一般而言，荧 光光谱在波长较长处。点击 “以表格形式查看 结果”，即可查看图谱的数据表，表中的数据可复制后粘贴到Excel 或 txt。

6）点击“查看光谱的峰”，可对光谱进行寻峰。在选择处理节点选项框中，选择光谱仪测量的数据，点击“下一步”。 

7）在设置基线选项框中，为了减小噪声等背景的影响，可以根据您的需求，勾选下 列选项：

? 选择“无”选项，软件会寻找的所有峰值。

? 选择“高级”选项，可以通过设置水平阈值，移除不相关的峰。

8）寻找峰的位置： 

根据您对峰值的要求，可以设定局部最大值、导数、最小峰宽等条件，在寻峰时

• “滑动平均”选项，是对光谱使用空间滤波，从而减小相邻的像素差异和噪声的影响。可选择滑动平均的滤波范围，滑动平均若使用不当，会造成一定波形失真。

• “S-G 滤波方法”选项，该选项要求同时设置滤波范围和多项式阶数，并且多项式阶数最大值不会超过滤波范围的 0.5 倍，比如滤波范围设置为 4，多项式阶数允许设置的最大值不超过 2。Savitzky-Golay 滤波器（通常简称为 S-G 滤波器）是一种在时域内基于局域多 项式最小二乘法拟合的滤波方法。这种滤波器如果设置得当，可以在滤除噪声的同时可以确保信号的形状、宽度不变。

9）根据您需要的参数，勾选想要在光谱上显示的数据。可选光谱寻峰，半高宽和中心波长等参数。注意，为了方便观察参数，请勾选“在图表上旋转文字”。点击

“完成”。

• 峰：指峰值波长，光谱图中强度最大值对应的光波长。
• 中心：指中心波长，对光谱进行高斯拟合后，高斯曲线的最大值对应的波长。
• 半峰宽：光谱内峰值强度一半处的峰宽度，即通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离。
• 四分之一峰宽：光谱内峰值强度四分之一处的峰宽度，即通过峰高的四分之一处作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离。
• 图心：指质心波长，是LED光谱分布的几何对称波长。
• 积分：指对峰的积分面积。
• 90%带宽：光谱带宽的定义是指谱线的空间宽度所对应的光谱宽度，这里指单峰起始波长之间90%的光谱宽度。

• 强度：光谱图中，峰值的强度大小。

10） 此时，在光谱显示窗口，出现您需要的数据。从窗口中，可以快速读出峰位和峰值强度的数据。

：开始连续采集光谱数据。

 : 单步采集光谱数据，单次采集后停止，点击运行，可继续采集。

 : 暂停采集光谱数据，终结采集过程。 

b） 点击图标进行数据保存的设置，包括数据保存格式、路径、保存方式等。点击“应用”按钮确认配置，之后点击“退出”按钮关闭对话框。

c） 点击启动设置，该按钮变红，表明保存工作正在进行。如果需要停止保存，请再次点击该按钮至恢复原样；

d） 也可以点击按钮，将全谱数据保存到电脑剪贴板，然后将数据直接粘贴 到Excel 或 txt。