(1. 钢铁研究总院,北京 100081; 2. 钢研纳克检测技术股份有限公司,北京100081)
摘 要:实验建立了一种能够快速准确分离、测定中药中不同形态砷的方法。使用高效液相色谱(HPLC)与电感耦 合等离子体质谱(ICP-MS)联用的方法,使用磷酸二氢铵和磷酸氢二钠作为色谱流动相,分离了砷酸盐(As(Ⅴ))、亚 砷酸盐(As(Ⅲ))、砷胆碱(AsC)、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)5种不同的砷形态,测定了陈皮、艾草、白果、 半夏、五加皮和细辛等6种中药中不同化学形态砷的含量。使用优化过的色谱条件,能够在7 min内完全分离砷的 5 种形态,不同形态砷的检出限分别为 0.74 ng/mL As(Ⅲ)),2.20 ng/mL(As(Ⅴ)),6.56 ng/mL(AsC),2.60 ng/mL (DMA)和0.34 ng/mL(MMA);半夏中不同形态砷的加标回收率为94.3%~113.5%。该方法能够快速分离5种不同 形态砷,对中药中不同化学形态砷含量实现准确测定。
关键词:中药;砷形态;高效液相色谱;电感耦合等离子体质谱
中图分类号:O657.63 文献标志码:A 文章编号:1000-7571(2018)增-0173-05
传统药材在我国使用已经有数千年历史,现在 中药的应用范围也越发广泛。然而,有研究表明, 砷在人体内有蓄积倾向,是致癌、致畸和致突变的 因子[1] ,《中国药典》规定中药中砷总量不得超过 5 mg/kg。然而,使用砷的总量来表示中药中砷的毒 性大小是不准确的。根据毒理学研究表明,砷的毒 性跟其化学形态具有密切关系。总的来说,含有有 机基团的砷形态毒性较小,无机砷酸盐毒性较大, 例如亚砷酸(As Ⅲ)和砷酸(AsⅤ)的毒性远远大于 一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA),而砷甜菜碱 (AsB)、砷胆碱(AsC)、砷糖(AsS)和砷脂(AsL)则几 乎没有毒性[2-3] 。因此为了更为准确的表示中药中 砷的毒性,准确测定不同化学形态的砷是必要的。 目前测定砷形态的方法在多种领域有应用,例如食 品[4-5] 、大气[6] 、海产品[7] 和花粉[8] 等。
本文测定中药中砷总量的时,采用了微波消解 方法进行前处理,使用 ICP-MS 对中药中砷的总量 进行测定。分析砷的不同化学形态时,使用了 HPLC与ICP-MS联用技术,对HPLC的分离条件进 行了优化,加快了分离速度,降低流动相盐度,实现 了对砷酸(As Ⅴ)、亚砷 酸(As Ⅲ )、一 甲 基 砷(MMA)、二 甲 基 砷 (DMA)和砷胆碱(AsC)快速分离测定。本方法比 2015版《中国药典》中砷形态分析分离时间缩短了 8 min,比食品安全国家标准[9] 中砷形态分离测定时 间缩短了4 min。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
PlasmaMS 300电感耦合等离子质谱(钢研纳克 检测技术股份有限公司);LC 3000高效液相色谱仪 (北京创新通恒);Excel微波化学工作平台(上海屹 尧仪器科技发展有限公司);LD-3离心机(江苏荣华 仪器制造有限公司)。
陈皮、艾草、白果、半夏、细辛和五加皮(北京市 购)。
砷形态标准储备液(GBW08666,GBW08667, GBW08668,GBW08669,GBW08671,中国计量科 学研究院)。总砷标准溶液(1000 μg/mL,钢研纳克 检测技术有限公司)。
磷酸二氢铵(GR,国药集团化学试剂有限公 司),磷酸氢二钠(GR,天津市光复科技发展有限公 司)。
实验用水为超纯水。
1.2 样品处理
1.2.1 测砷总量
称取 0.500 0 g 样品于聚四氟乙烯微波消解罐 中,加入 7 mLHNO3和 1.5 mLH2O2,室温静置 1.5 h, 将消解罐置于微波消解仪中,按表1中程序设定进 行消解。消解完成后,将样品转移至50 mL聚四氟 乙烯烧杯中,置于电热板上于100 ℃下将溶液浓缩 至近干,取下,冷却至室温,加入1 mLHNO3和适量超纯水,重新放置于电热板上,加热至微沸,取下冷 却至室温后转移至50 mL塑料容量瓶内,用超纯水 定容至刻度。同时,做样品空白。
表1 砷总量测定微波消解程序
Table 1 Microwave digestion program for the determination of total As
1.2.2 测形态砷
为了得到更好的提取效果,使用了3种方法:
(1)酸热提取法:称取1.0000 g样品,置于50 mL 聚丙烯离心管内,加入15 mL 0.2 mol/L HNO3,密闭 后于100 ℃下提取2.5 h,每0.5 h振摇1 min。提取完 毕后,将溶液冷却至室温,置于离心机上以6 000 r/min 离心15 min,取上层清液 3 mL 通过 0.45 μm 有机系微孔滤膜,待测。同时做样品空白。
(2)超声提取法:称取1.0000 g样品置于50 mL 聚丙烯离心管中,加入1 mL甲醇和9 mL超纯水,超 声萃取30 min,冷却至室温后,于6 000 r/min离心机 离心15 min。取5 mL上清液于烧杯中,置于100 ℃ 电热板上,微热后取下,转移至10 mL容量瓶内,冷 却至室温后用超纯水定容至刻度,取3 mL定容后溶 液通过 0.45 μm 微孔滤膜后,待测。同时做样品空 白。
(3)水热提取法:称取1.0000 g样品,置于50 mL 聚丙烯离心管内,加入 15 mL 超纯水,密闭后于 100 ℃下水浴提取2.5 h,每0.5 h振摇1 min。提取完 毕后,将溶液冷却至室温,置于离心机上以6 000 r/min 离心15 min,取上层清液3 mL通过0.45 μm有机系 微孔滤膜,待测。同时做样品空白。
1.3 仪器工作参数
使用 PlasmaMS 300 测定 As 选用 m/z=75 处数 据,使用He作为碰撞池气体,排除Ar-Cl干扰;色谱 柱选用 Hamilton PRP-X100 阴离子交换柱,具体仪 器工作参数如表2所示。
2 结果与讨论
2.1 砷总量的测定
中药的主要成分为有机物,选择 HNO3和 H2O2 混合为消解酸,在放入酸的初始阶段,会产生大量 气体,需静置待消解罐内样品不再产生气体时方可进行微波消解程序。
2.2 提取方法
食品中砷形态分析的国家标准方法提取砷使 用酸热提取法3,水热和超声辅助萃取法是环境、食 品等样品砷形态分析常用的方法 4。在本次实验 中,经过对比发现,水热法和超声辅助萃取法未能达到提取砷形态的目的,不能准确反应砷各种形态 在中药中的准确含量。因此本实验选择酸热法进 行砷的提取。
2.3 分离性能
目前对于 As 形态分离,主要采用磷酸二氢钾 (KH2PO4)与磷酸氢二钠(Na2HPO4)混合溶液作为流 动相分离四种As的形态。本实验中对比了上述方 法 与 磷 酸 二 氢 铵(NH4H2PO4)和 磷 酸 氢 二 钠 (Na2HPO4)混合溶液作为流动相的分离时间与分离 效果。使用KH2PO4-Na2HPO4体系作为流动相,分离 五种形态 As 所用时间为 420 s;使用 NH4H2PO4-Na2HPO4体系作为流动相,分离五种形态As所用的 时间为400 s;两种体系分离时间大致相同,然而使 用KH2PO4-Na2HPO4体系时,基线的强度(CPS)大于 30 000,结果导致空白测定值过高,检出限高,盐浓 度( 质 量/体 积 )为 0.8% 左 右 ;使 用 NH4H2PO4- Na2HPO4体系时,基线 CPS 为 6000 左右,盐浓度为 0.67%左右;综合考虑,降低基线强度,提高检出限, 降低盐浓度,防止锥堵塞,选择NH4H2PO4- Na2HPO4 体 系 作 为 流 动 相 。 Z 终 流 动 相 为 44 mmol/L NH4H2PO4与 13 mmol/LNa2HPO4,能够在 400 s 内完 全分离As的5种形态,分离效果如图1所示。
2.4 校准曲线和检出限
分别配制浓度为1、5、8、10、20 ng/mL和50 ng/mL 含有5种形态砷的混合标准溶液。得到5种形态砷的校 准曲线线性相关系数 R2 >0.999。不同形态砷的检出限 是以2倍信噪比(S/N=2)计算,得到结果分别为:0.74 ng/ mL(As Ⅲ),2.20 ng/mL(As Ⅴ),6.56 ng/mL(AsC),2.60 ng/mL(DMA)和0.34 ng/mL(MMA)。
2.4 加标回收结果
选取半夏样品,进行加标回收率实验,分别做 砷总量加标回收实验和5种形态砷加标回收实验。 在样品进行处理前分别加入不同的标准溶液,进行 测定。其结果如表3所示。
2.5 样品分析
对陈皮、艾草、白果位、半夏、细辛和老鹤草 等 6 种市售中药材中 5 种砷形态及砷总量进行 了分析,其结果如表 4 所示。结果表明:所做几 种中药中砷主要以 As(Ⅲ)形式存在,有机砷含量较低。
3 结语
通过对比酸热提取,超声辅助萃取和水热提取 法,Z 终选择酸热提取法作为砷形态分析的样品前处理方法,此方法提取效率相对于其余两种方法较 高。通过优化流动相的选择,降低了流动相的盐 度,加快了分离不同形态砷的速度,使之更适合于 HPLC与ICP-MS的联合使用。对陈皮、艾草、白果位、半夏、细辛和五加皮等6种常见中药材总砷含量 及5种不同形态砷进行了分析。结果说明:HPLC与 ICP-MS联用能够对中药中砷的5种不同形态进行 快速分离和准确测定。
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