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刚刚结束的五一小长假,Q博士见到越来越多的人出门踏青,这意味着国内疫情防控的常态化,人们对正常出街的安全性越来越有信心。然而不时发生的“假阴性”现象也仍然是科学家和普通群众愈发关心的关键问题。
今天Q博士带大家走入核酸检测的常用方法PCR方法,以及如何在PCR检测过程中降低检测结果假阴性概率。
什么是PCR技术?
PCR技术又称为聚合酶链式反应。是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的Z大特点是能将微量的DNA大幅增加。
在新冠病毒检测中,核酸检测被定义为临床诊断的金标准,RT-PCR技术被反复提到,它是一种将RNA反转录和PCR相结合的技术。首先在反转录酶的作用下,将提取到的RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,在DNA聚合酶作用下不断扩增(变性-退火-延伸多个循环)合成目的片段并进行分析。
PCR用水
PCR技术目前多搭配试剂盒使用,也有用户自行制备反应体系,无论哪个过程都需要使用水。无论是近年来季节性爆发的甲流乙流,还是目前都在经历的新冠病毒,在检测过程中都涉及一个痛点,那就是如何尽可能提高核酸检测的准确性,减少假阴性结果出现的可能性。
我们首先分析一下假阴性结果出现的原因,以新冠病毒核酸检测为例,假阴性的主要原因有:
1 病人病程:不同病程,患者体内病毒载量不同;
2 采样部位:咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等不同采样部位病毒载量均不同;
3 采样准确性:拭子质量,工作人员操作等;
4 试剂盒的质量:引物设计以及水质控制。
为了顺利将提取到的RNA反转录并实现DNA的成功扩增,必须YZ核糖核酸酶(RNases)的降解作用,如果试剂盒用水内含RNases,将极有可能导致假阴性结果的出现。
去除RNases的主要方法
1 高压灭菌:即便是在180℃下高压灭菌4h之后,RNases仍保持某些活性,且某些细菌失活会释放更多的RNases;
2 DEPC法(二乙基焦碳酸酯处理法):利用二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理方法使酶失活是用来YZ水溶液中RNases活性的常见方法。然而,二乙基焦碳酸酯是一种可疑致癌物,处理须小心;同时该方法虽然能够使酶失活,却无法将其从水中去除,同时清除多余的DEPC过程中,会产生乙醇,二氧化碳等其他污染物;
3 超滤法:超滤是一种真正能够从水溶液中清除RNases的方法。默克Milli-Q®选用内置在丙烯腈丁苯橡胶(ABS)外壳中的聚砜超过滤膜作为超滤柱的主要成分,在一定水流速一定浓度范围内,超滤具有充分的截留作用。超滤处理可有效取代DEPC处理方法生产无RNases水。
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