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- ifuesqrozbzybl 2018-04-16 00:00:00
- 细胞污染很多种，不同种细胞污染表现不同，可能检测方法不同。不过大部分污染用肉眼加镜检就可以解决。 细胞污染一般分细菌污染，真菌污染，支原体污染，黑胶虫等。 细菌污染：pH升高培养基变黄，培养基严重浑浊，镜下可见细菌游动； 真菌污染：培养液短期内多不浑浊，有肉眼可见漂浮物，镜下细胞间有菌丝体，生长变慢，时间长细胞死亡； 支原体污染：细胞生长一般无可见变化，可用支原体检测试剂盒检测支原体污染（现在市场上有卖，有检测支原体DNA的，灵敏度高但过程复杂；非检测DNA的过程简单） 黑胶虫：培养液不浑浊，细胞生长影响不大，镜下有小黑点做布朗运动；
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- 细胞被“黑胶虫”污染了，怎么办？
正在培养的细胞状态“突然”恶化！在显微镜下观察，感觉有黑点状的不明物体在游动！
但没看见悬浮物，也没感觉培养基pH变化速度加快。
是不是支原体？
但支原体怎可能在低倍数显微镜下看得这么清楚？
难道是它？？？
科研学术圈一直流传着这样一种生物——它，可以污染细胞，污染后短期内不会影响贴壁生长的细胞贴壁；同时污染后的培养基也不会像细菌、真菌污染之后的培养基迅速变黄浑浊，有菌丝团漂浮在上清中。但是，没有人能确切地说出它到底是原虫还是其他病原微生物，也没有一个标准的图像记录，不管是相机实拍还是扫描电镜，甚至都没人能确定到底是“黑焦虫”还是“黑胶虫”。
1.“黑胶虫”究竟是什么？
有研究人员通过检测，发现实验室的“黑胶虫”为变形杆菌a-2亚群，其存在于胎牛血清中。
但后又有研究表明“黑胶虫”并非生物，而是一种碳酸钙纳米颗粒或硅复合物，称其为“硅小体”，来源于培养基对玻璃细胞培养器皿的侵蚀。
在“黑胶虫血清”的说法流行后，也有研究者表明自己实验室相似的情况出现原因是由于细菌污染，并从被“黑胶虫”污染的细胞培养基中分离到了一株短波单胞菌属的新菌株[1]。实际上，并不是所有的细菌污染马上就会导致细胞立即死亡，也不是所有的污染会让培养基变黄且浑浊，相反有时细菌污染会让培养基变得更红（细菌分解蛋白质产胺会导致pH值上升因此变红）。
很多人猜测，所谓的“黑胶虫”可能只是凋亡小体或细胞碎片，因为细胞状态好的时候就看不到了，而当颗粒物直径足够小，在液体中做不规则的布朗运动也很正常。尽管到目前，关于黑胶虫究竟是什么仍无定论，但我们应尽量避免“黑胶虫”污染。
2、如何避免或应对“黑胶虫”污染？
采用原装进口特级胎牛血清。
出现问题的培养体系中的血清，有很多是经过热灭活处理的，热灭活操作会使血清中产生线状的蛋白质聚合体，因其颗粒较小进行布朗运动便被认定为是生物，所以在进行血清融化的过程中要进行梯度处理，最适合在4℃缓慢融化
3.如果遇到“黑胶虫”污染怎么办？
换优质胎牛血清。
停止热灭活处理血清，目前大部分高品质血清都不需要热灭活操作，甚至通常因为较高温度处理后，血清质量受影响，细胞生长速率降低。同时热灭活过的血清，蛋白等沉淀物的形成显著增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染。所以在不是做免疫学研究或昆虫细胞培养等特殊场景时，血清尽量不经热灭活。
虽说是“黑胶虫”，但是其实有很大可能性是被其他微生物污染，如果对细胞状态影响很大，正常情况下应该直接丢弃，若细胞非常珍贵，可以用伯氨奎、磺胺、四环素、贝尼尔，庆大霉素进行洗涤。并尽早更换品质好的一次性细胞培养耗材以及相关培养试剂。
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凡在细胞培养环境中混入对细胞生长以及生存有害的成分以及造成细胞不纯的异物都应视为污染。
一般情况下，细胞污染根据污染源的不同，可分为物理污染、化学污染和生物污染。
物理污染
物理污染是细胞培养过程中Z容易被实验人员忽视的一种污染，往往是由一些放射性物质、辐射、或者是温度和其他物理环境的变化引发的。
这些物理性的变化会改变细胞培养体系中的一些生化成分，进而影响细胞的生长，导致细胞生长受YZ甚至死亡，或者细胞的代谢发生变化。
通过合理设计细胞房布局和规范实验操作可以大大降低物理污染的概率。
一些会引发机械震动的设备如涡旋振动仪、离心机等，建议不要放在二氧化碳培养箱附近。常用试剂按照存放要求（4℃或者-20℃的温度条件下，某些特殊试剂有避光的要求）置于固定的位置，并且避免周围有同位素或者其他放射性物质的存在。
操作上，培养箱在使用过程中，尽量避免频繁开关门以免造成二氧化碳浓度和温度的长时间或者大幅度的波动。处理细胞（如进行传代操作）时，也不宜长时间让细胞处于室温状态，影响其生长。同时，用于细胞培养的培养基、缓冲液、胎牛血清等，一般情况下需保证温度在37℃左右时再用于细胞，以免温度过低损伤细胞。
化学污染
化学污染往往存在于培养环境的各种介质中，造成细胞培养过程中常见的污染之一。
培养介质中的杂质、水、试剂、耗材、以及常用的玻璃器皿等都可能造成化学污染。
在细胞培养过程Z常使用到的水（包括蒸馏水、双蒸水、超纯水等），或多或少都会存在一些杂质。即使是去除了金属离子、内毒素等的超纯水，也会随着放置时间纯净度会下降，在实验室中尽量需要现配现用。另外，大部分自行配制的试剂溶液，依据性质不同需要通过过滤或者高温灭菌的方式除去其中的杂质。
在细胞培养过程中，牛血清是必不可少的一个天然添加物。但由于血液物质的成分复杂性，导致每一批次的血清制品都会有略微的差别。尽可能的使用同一批次的血清产品，是保证减小化学化境变化的前提。
一些常用的玻璃器皿，清洗不到位（建议多层级清洗后再用蒸馏水润洗）也会导致一些清洗剂的残留，进而影响其盛放试剂的纯度。
生物污染
生物污染是细胞培养新手Z容易遇到的一种污染情况。通常情况下科研人员普遍认知的污染是细菌污染，其实生物污染还包含真菌、病毒、支原体、酵母等其他微生物以及不同细胞之间的交叉污染。
酵母污染
（图源：UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center）
实验室常见的细菌通常是大肠杆菌、葡萄球菌等。细菌污染比较容易察觉，细菌的快速增殖会产生大量的酸性代谢物质，导致培养基迅速变黄，并有肉眼可见的浑浊现象。在细胞培养过程中，如无特殊要求，在培养液中加入一定浓度的抗生素是有助于抵御细菌污染的。
细菌污染
（图源：UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center）
相较而下，真菌的生长就会缓慢许多，其对细胞培养体系的影响也相对较慢。一般情况下，实验室常见的产生污染的真菌多为白色念珠菌、酵母菌、黑霉菌等。这些菌株在污染后期往往会形成白色或者是黄色的肉眼可见的漂浮物，在高倍显微镜下也可以看到明显的菌丝。
真菌污染
（图源：UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center）
而对于病毒和支原体这种污染情况，则更难在污染初期被研究人员察觉，并且会在潜移默化中对细胞的生长增殖产生一定的危害与影响。
支原体污染
（图源：Contamination of Tissue Cultures by Mycoplasmas）
另外，细胞污染也是一种生物污染，如在多个细胞系培养的过程中，某细胞混入了另一种细胞的培养体系，导致不纯。这种情况通常是实验操作人员进行同时对多种细胞传代或者处理时未更换移液枪枪头或是共用移液管等造成的。严格标准化的操作流程可以避免这种情况的发生。
总之，生物污染的发生和化学污染类似，通常是多因素的。通常情况下，保持实验人员个人的卫生与正确的操作方式、管理好细胞房的布局与良好的通风体系、严格控制所用关键试剂与耗材的来源与品质，是降低生物污染的先要。如在某些疯牛病疫区产出的胎牛血清，其血源有很大风险携带疯牛病毒、口蹄疫病毒等影响细胞生长的病毒。同时，某些品质不好的血清还会带来黑胶虫污染的困扰。选择海关允许合法进口的并且有严格质检的牛血清产品，就能从根源上杜绝胎牛血清带来污染的可能性。
瑞沃德AlphaCell特级胎牛血清，其血源来自新西兰和澳大利亚的天然纯净牧场内严格编码的牧牛。采用世界ling先的心脏穿刺技术采集原料血，通过低温离心、多次过滤，并于超洁净车间进行无菌灌装后，再冷链运输至国内，全程严格监管，有效杜绝污染。
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