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热门问答
- 用普通pcr qpcr 检测基因 有什么区别
- 普通PCR引物 VS qPCR 引物
导读
说起引物，大家都再熟悉不过了。引物，在核苷酸聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。无论是做普通PCR还是荧光定量PCR，设计合适的引物是非常关键的一步。
普通PCR和荧光定量PCR的检测方式具有较大的差别。荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光，普通PCR通过检测插入DNA中核酸染料的量来测定PCR产物量。荧光定量PCR可以通过扩增曲线进行精确定量，普通PCR则是通过电泳的方式进行定性分析。那么在普通PCR和荧光定量PCR的引物设计方面，有什么相同点和不同点呢？今天小编就给大家汇总一下。
相同处：
▶ 序列的查找是一致的。
▶ 序列选取应在基因的保守区段。
▶ 选取合适的扩增片段大小。
▶ 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对。
▶ 避免引物自身形成环状发卡结构。
▶ Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%。
▶ 引物之间的Tm相差避免超过2℃。
▶ 引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。
不同处：
荧光定量PCR 引物
▶ PCR产物长度：要求在300bp以内，一般选80-150bp之间。
▶ 引物特异性：对引物要求高，尽量减少引物二聚体的产生，熔解曲线要求单一产物。
▶ 扩增效率：荧光定量 PCR的目的是进行定量或者相对定量，扩增效率应在90%—110%之间。
▶ 多对目的基因同时扩增，文献上查来的引物条件会不同，需要设计尽可能条件一致的引物。
▶ 目的基因含量比较低时，需要设计灵敏度比较高的引物。
普通PCR 引物
▶ 普通PCR的扩增长度，根据实验的要求不同，一般是从150bp到几千bp不等。
▶ 相对于荧光定量PCR，普通PCR对二级结构要求较低。
▶ 对扩增效率要求不高。
▶ 可以选用梯度PCR仪，选择不同退火温度，对引物退火温度要求不需要一致。
Cielo™实时荧光定量PCR系统
Harness of the power of qPCR
☑ 数据可靠性：连续1000次实验后，结果高度一致。
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- Gene-π数字PCR—Drop-off方法检测基因缺失
数字 PCR (dPCR)可以提供比传统qPCR更高的精准度和灵敏度，尤其是在肿瘤学应用中，dPCR能精准且可靠地检测到较低浓度样本中的稀有突变等。
目前，使用Drop-off方法可以同时检测基因组内发生的多个序列插入、缺失或碱基突变，最大限度地提高单个检测中样本的数据输出，节省时间和检测成本。本文以naica®微滴芯片数字PCR平台为基础，对使用Drop-off方法检测基因缺失进行阐述。
首先，为大家介绍一下Drop-off方法原理：
☑ Drop-off是指利用探针在一个反应中检测基因组序列的同源基因突变（包括核苷酸的缺失，插入和替换）。
☑ Drop-off方法包括两个TaqMan 探针：一个与野生型序列互补而与突变位点不发生互补的Drop-off探针和一个与突变型和野生型基因都互补的Reference探针（如下图A）。
☑ 当野生型等位基因存在时，Drop-off探针和Reference探针都将与目标序列杂交，产生双重阳性信号（如下图B，蓝色群）。相反，如果存在突变的等位基因，即使一个核苷酸的突变也会阻止Drop-off探针与之杂交，因此只有Reference探针与目标基因结合，从而得到一个阳性信号（如下图B，绿色群）。
A.Drop-off和Reference探针及引物在目标基因上的示意图（FP：上游引物，RP：下游引物）
B. Crystal Miner 2D图中显示来自双阳性野生型等位基因的荧光簇（天蓝色：蓝色和绿色）和突变等位基因的荧光簇（绿色）及阴性微滴簇（黑色）。Drop-Off探针仅和野生型序列互补，而跳过突变序列（图B，纵坐标的蓝色通道）；Reference探针与突变和野生型等位基因进行互补（图B中横坐标的绿色通道）。
野生型浓度CWT可以直接从双阳性微滴中PWT的比例得出。但是，Drop-off突变体浓度Cmut必须从确信包含突变等位基因的微滴比例Pmut中得出。
由于野生型和突变等位基因可能被分配到同一个微滴里面，因此采用双阳性微滴对突变体进行定量是不准确的，只能通过排除双阳性微滴来确定Pmut（将突变阳性群体定义为对Reference探针呈阳性但对Drop-off探针呈阴性的微滴）。
上文已对检测原理和检测方法进行了阐述，那么如何对Drop-off检测结果进行分析呢？
1、使用高灵敏naica®微滴芯片式数字PCR系统的蓝色和绿色两个通道对突变等位基因（MAF）进行绝对定量。
2、使用Crystal Miner分析软件进行量化分析计算。
A 、通过自主圈群功能选中三种微滴群体并进行命名-突变型阳性（绿色），双阴性（黑色），野生型双阳性（天蓝色：蓝色和绿色）。
B、通过naica Crystal Miner软件获得Drop-off突变型的浓度Cmut（绿色），以及野生型浓度CWT（天蓝色）。
C、计算MAF Drop-off突变，即MAF Drop-off=Cmut/（Cwt+Cmut）。
小提示：
如果不排除双阳性的微滴并将其归为阴性微滴中， Drop-off突变体的MAF则会被低估，对于任何Cmut＜100cp/µL，这一系数几乎是恒定的（例如在样品中CWT为500 cp/µL时，低估了25%）。保留双阳性微滴既不会降低测得的Drop-off突变体浓度的相对不确定性，也不会降低LOD。
应用亮点：
☑ 通过使用naica Crystal Miner圈群功能，可以对Drop-off突变进行精准定量。
☑ 排除模棱两可的微滴，在不降低测量精度的前提下避免了低估Drop-off突变体的浓度。
☑ 本次检测使用了naica®微滴芯片数字PCR系统的蓝绿两个通道，第三个检测通道还可以添加一个内部对照或同时量化一个MAF点突变。
naica®微滴芯片数字PCR系统
法国Stilla Technologies公司的naica®微滴芯片数字PCR系统在进行核酸检测时具有独特的优势。该系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作为数字PCR过程的耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要2.5小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。
naica®六通道微滴芯片数字PCR系统
法国Stilla Technologies公司naica®六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的juedui拷贝数浓度。
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- PCR/qPCR耗材选择的几个主要因素!
PCR/qPCR耗材选择的几个主要因素!
1.塑料耗材组成：
材料
PCR/qPCR耗材通常由聚丙烯制成，因为它是惰性的并且能够承受热循环过程中温度的快速变化。 聚丙烯的惰性性质使其对于反应物质的吸收降低至最小，确保获取最佳的PCR结果。为了进一步保障在纯度和生物兼容性方面的批次间一致性，应当在生产过程中使用全新未循环使用的医学级或分子生物学级高品质聚丙烯原料。请注意，某些PCR / qPCR板边框用更强的聚碳酸酯制成，以与高通量机器人应用兼容。
颜色
PCR管和板通常可提供多种不同的颜色形式，以便于对于样品的视觉区分和鉴别，特别是在高通量实验中。尽管塑料的颜色对DNA扩增没有影响，但在设置实时PCR或qPCR的反应时，与透明耗材相比，我们更推荐使用白色塑料或磨砂耗材，以实现灵敏和准确的荧光检测(图43)。
白色耗材通过阻止荧光折射出管来提高qPCR数据的灵敏度和一致性。折射被最小化时，更多的信号被反射回检测器，从而增加信噪比。此外，白色管壁可阻止荧光信号传递至PCR仪模块，避免被吸收或不一致地反射荧光信号，从而使重复实验中的差异降至。由于每个品牌仪器的设计不同，请遵循厂家建议以获得最佳性能。比如，对于Bio-Rad和Roche品牌的定量仪器，推荐使用白色耗材用于qPCR。而对于Applied Biosystems荧光定量PCR仪，推荐使用磨砂孔耗材。
PCR/qPCR塑料耗材要点：
PCR/qPCR塑料耗材可提供多种规格和形式。了解他们相应的特点和相关术语将会帮助您在使用这些塑料耗材时获得最佳的PCR和qPCR结果。
一般属性
反应规模或加样体积
PCR/qPCR塑料耗材的加样体积决定了可成功进行的PCR/qPCR反应的规模(体积)。过量的加样将会导致热传导的效率下降，溢出以及交叉污染。另一方面，加样不足则会导致样品因蒸发而损耗。加热模块也决定了可使用的塑料耗材尺寸以及它们对于完整而有效热传导的最佳适配性。PCR/qPCR耗材的最常见体积规格为：
管：0.5 mL, 0.2 mL, 0.1 mL
96 孔板：0.2 mL, 0.1 mL
384 孔板：0.02 mL
裙边：
PCR / qPCR板的“裙"是板周围的板。裙边可为反应体系构建时的移液过程提供较好的稳定性，以及在进行自动机械处理时提供更好的机械强度。PCR / qPCR平板可分为无裙边，半裙边和全裙边。
无裙边板缺少周围的面板。这种形式的反应板可与绝大多数PCR仪和实时PCR仪的模块适配，但不适用于自动化应用。
半裙边板在板的边缘周围具有短的边缘,在移液过程中提供足够的支撑并且为机器人处理提供机械强度。
全裙边的 PCR / qPCR板具有覆盖板高度的边缘面板.这种板形式适用于具有突出模块的PCR仪(可有利于自动化操作)，可安全稳固适配。
- 荧光定量PCR(qPCR)方法用途及说明
荧光定量PCR(qPCR)方法用途及说明
荧光定量PCR法(qPCR)：是在常规PCR基础上，将『针对支原体特异性保守序列的探针』做荧光标记，使PCR扩增后的产物带有荧光，利用荧光信号的变化和配套软件，进行DNA扩增反应的实时监测，简称qPCR。
(经典法)
1) 符合欧洲药典、中国药典要求，更适合细胞zhil，CAR-T，抗体药、疫苗等临床项目申报和质检。
2)样本需先做DNA抽提。抽提后样本加入量为10μl。
3) 厂家可协助完善方法验证步骤。
支原体荧光定量PCR(qPCR)检测试剂盒(一步法)
1)适合科研单位检测，或单位内检，用荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞或其他生物基质。
2) 比药典操作标准合并了一步，(将内控对照试剂预先混合在PCR mix试剂中)，操作更简洁。
3)样本量为2μl，灵敏度为50个基因组拷贝/反应。结果准确。
优点：
①灵敏度高、特异性强。
②时间短，2-3小时出结果。
③检测结果可定量。
④操作简便。
缺点：
①对于已做支原体灭活处理的样品，由于支原体DNA仍旧存在其中，PCR结果会出现假阳性。(可用培养法做补充验证)
②不同厂家生产的试剂盒质量差异巨大(由于引物及内在设计不同)，需谨慎选择，尽量在专业人员推荐指导下使用。
荧光定量PCR(qPCR)方法用途及说明，先和大家介绍到这，如果想要了解更多荧光定量PCR的信息，可以关注天津本生生物，业给生物医药客户提供生物实验室检测试剂及耗材，欢迎广大客户来询。
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PCR耗材,0.2ml 8联排管盖, 拱顶盖(凸盖), 无DNA酶无RNA酶无热源, 无色.
进口PCR板,40μl384孔全裙边白PCR板
PCR耗材,200μl 96孔半裙边 PCR 板,白色
PCR耗材,100μl 96孔半裙边 PCR 板,透明
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