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本文节选自《实验卒中手术学》主编：杨国源

书号：ISBN 978-7-5046-6264-4/R·1648

氯化三苯基四氮唑（TTC）染色

       氯化三苯基四氮唑TTC（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride）染色是一种定量检测脑梗塞体积的迅速、方便、便宜、可靠的方法，它是一种用于评价组织内脱氢酶活性的标准染色方法。大脑切成2毫米的切片后，放入2%TTC溶液中，TTC能与正常线粒体氧化酶系统发生反应而降解成深红色，而梗塞部位受损以致线粒体缺乏降解TTC的酶的能力而不会被TTC染色，呈现白色，使得受损组织与正常组织极易区分开来。

       目前，很多学者釆用TTC染色标记脑组织缺血性损伤，计算脑梗死灶体积。该方法能清楚地区分正常脑组织和梗死脑组织的界线，但要求实验者在取材时要速度快，在极短时间内将组织投入TTC溶液中。组织中断血供时间过长，会造成新的损伤区域，致使测量出现较大误差，甚至组织完全不能染色。剥离和切片时应十分注意。因为脑组织十分脆软，容易出现碎裂，给测量带来不便（如下图所示）。

MCAO术后TTC染色

白色为梗塞部位；深红色为正常部位

一、实验材料

       1.TTC溶液。

       2.磷酸盐缓冲液。

       3.刀片。

       4.大脑模具。

       5.培养皿。

       6.载玻片。

       7.4%多聚甲醛。

二、TTC染色过程

       1.动物处死后，取脑并且小心地浸入低温磷酸盐缓冲液中。这样使大脑更加坚硬，方便切片。

       2.用刀片把大脑切成2毫米厚片。

       3.切片时要小心，因为脑组织容易粘在刀片上。为了防止损伤，刀片先浸入2%TTC溶液中。TTC溶液对光和热敏感，在不使用的时候要用铝箔包好。切好的脑片放入TTC溶液中进行染色并且持续观察颜色的改变。可以加热使这个过程变快，比如放入37℃的培养箱。

       4.当脑片表面开始变成粉红色，翻转脑片。染上色的是具有活性的脑组织。梗塞的部分由于线粒体失活，所以不能被染色，仍然为白色。

       5.当脑片变成红色，反应结束，用磷酸盐缓冲液洗去TTC溶液。

       6.脑片要进行拍照，来确定梗塞量。也可以把脑片放入多聚甲醛中过夜进行固定。这样拍照更加方便。此步一定要注意避光，否则染色还会褪色。

三、应用TTC检测的注意点

       1.TTC染色是计算梗塞量的标准方法。

       2.TTC溶液对光敏感，因此要避光保存。

       3.染色前是否进行磷酸盐缓冲液灌注不影响实验的结果。

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小动物核磁共振成像系统在毒理学病理学中活体成像应用

一个新的紧凑型高性能小动物磁共振成像平台（M3），该系统使用一种新的磁铁设计和一套相关的软件，降低了小动物磁共振成像仪的成本和复杂性。这个新的MRI平台为没有磁共振或成像专业知识的病理学家提供了获得活体实验动物MRI和离体MRH高质量图像的机会，从而可以大大增强临床前毒理学研究和动物疾病模型开发中的常规组织病理学研究。

与超导小动物磁共振成像系统不同，紧凑型高性能小动物磁共振成像平台是可移动式和自屏蔽的，因此M3可以放置在大多数实验室或研究设施中，不需要特殊的屏蔽室、冷冻剂或冷却剂，也不需要专用的电气或管道供应。此外，紧凑型高性能小动物磁共振成像平台具有专用的软件和硬件以及预先编程的协议和样本处理系统，以方便病理学家对活体动物或离体的动物样本进行高通量成像。

紧凑型高性能小动物磁共振成像平台的优点是能够纵向监测疾病（活体MRI）和快速获取离体组织的多个切片（离体MRH），从而提供整个靶器官的三维数字形态学详细数据，同时保持标本完整，以便后续常规组织病理学检查。与传统组织病理学提供的有限数量的二维（2-D）组织切片相比，核磁共振技术可以对毒理学效应和疾病进展进行更全面的评估。

小鼠肝脏局灶性病变案例

活体磁共振成像在模型小鼠中检测到局灶性肝损伤（图A）。肝脏的高分辨率离体MRH评估可以在小鼠（图B和C）中鉴定几个单独的局灶性脂肪病变。通过常规组织病理学证实病变为局灶性脂肪改变（图C）。

Aspect M7™小动物核磁共振成像系统

[1] Tempel-Brami C , Schiffenbauer Y S , Nyska A , et al. Practical Applications of in Vivo and ex Vivo MRI in Toxicologic Pathology Using a Novel High-performance Compact MRI System.[J]. Toxicologic Pathology, 2015, 43(5):633.

本文节选自《实验卒中手术学》主编：杨国源

书号：ISBN 978-7-5046-6264-4/R·1648

1.冰冻切片苏木素伊红染色

1、将4%多聚甲醛灌注后的大脑，用冰冻切片机切片，厚度为10~40微米。

2、将脑片贴在载玻片上，并且吹干过夜。

3、将脑片脱脂（若是脑组织直接冰冻，则不需要脱脂）：

       （a）将脑片浸没在氯仿和乙醇混合物中至少1小时。

       （b）将脑片分别在、95%、70%和50%的乙醇中各浸泡5分钟，然后用蒸馏水冲洗。

注意：必须等到片子完全干燥（没有水滴）。如果脑片是几天前准备的，在染色之前必须放到蒸馏水中浸泡5分钟。

4、染色步骤：

       （a）将苏木素滴在脑片上，染色20~25分钟。整个过程用眼睛或显微镜观察，保证细胞核变蓝。

       （b）用蒸馏水洗2次。

       （c）用0.25%的氨水溶液轻轻冲洗约10秒。

       （d）用蒸馏水洗2次。

       （e）用伊红染色10秒

       （f）用蒸馏水洗2次。

       （g）用70%、80%、90%、95%、的乙醇脱水1次，每次3分钟。

       （h）用乙醇与二甲苯混合液脱水3分钟。

       （i）用二甲苯处理5分钟

       （j）滴2~3滴封片剂，用盖玻片封住脑片，准备在显微镜下观察。

2.石蜡切片的苏木素-伊红染色

1、修剪组织：如果大脑固定在4%6的多聚甲醛里，那么修剪组织必须在通风橱里进行。去除小脑和嗅球部分。大脑用水冲洗干净，冠状切片切成3份。组织放在生理盐水中。

2、处理以及石蜡包埋：在自动包埋机上进行包埋。金属盒放在机器中过夜。组织进行梯度脱水，并用石蜡进行包埋。

3、组织包埋的步骤:

       （a）加热温度控制在59~61℃；

       （b）样品控制台温度在59~61℃；

       （c）冷冻台温度为5℃；

       （d）组织转移到加热台上，浸在石蜡中，然后移至样品控制台。

注意：不要把样品放反了，同时要保持它们的方向一致。把铁块放在冷冻台上，冷却20分钟。

4、室温下在切片机上切片：

       （a）水浴温度控制在45~50℃。

       （b）石蜡组织放在冰水混合物中。

       （c）室温下设置好切片机。

       （d）45℃，吹干载玻片20分钟。

       （e）蜡块固定在切片机上，修整蜡块表面，直至大脑组织出现。

       （f）切片，厚度可根据试验要求，切成4~10微米。

       （g）脑片转移到水浴中，然后贴在载玻片上。

5、预染：载玻片在60℃的烘箱中烤片15分钟，融化石蜡，使乙醇挥发。注意用架子架住载玻片。

6、HE染色：可以自动也可以手动进行。

1）自动：染色在染色机中进行，依次用以下溶液处理：

       （a）3次二甲苯；

       （b）2次乙醇；

       （c）2次95%乙醇；

       （d）苏木素染色；

       （e）2次95%乙醇；

       （1）70%乙醇；

       （g）伊红染色；

       （h）70%乙醇；

       （i）3次二甲苯。

2）手动：每一步骤约1~2分钟，整个过程需要25~30分钟。载玻片放入盒子中，滴2~3滴封片剂，然后用盖玻片小心地盖在上面。

① 注意事项：

       （a）封片前片子不要干燥，封片剂将地封住脑片；

       （b）在完全干燥之前保证片子平整；

       （c）在显微镜下观察片子的染色效果。例如：如果组织在冰盒中的浸泡时间不足够长，组织看起来会有皱褶。如果漂片温度太高，片子会碎，如果温度太低，片子不能漂浮。

② 手动的HE染色方法：

       （a）3次二甲苯，每次2分钟，脱去脂肪和蜡；

       （b）乙醇，每片10滴；

       （c）95%乙醇，2次，每片10滴；

       （d）蒸馏水洗；

       （e）苏木素染色15分钟；

       （f）蒸馏水洗2次；

       （g）0.25%氨水洗，直至组织变蓝；

       （h）蒸馏水洗2次；

       （i）0.5%的伊红染色，每片10~20滴；

       （j）95%乙醇，洗2次，每片10~15滴；

       （k）乙醇，每片10滴；

       （l）3次二甲苯，每片10滴。

苏木素伊红染色后细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色或红色。如下图所示：

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安捷伦科技公司（纽约证交所：A）和Visiopharm近日宣布达成合作营销协议。这一消息已于2020年2月29日至3月5日在加州洛杉矶举行的USCAP（美国和加拿大病理学会）第109届年会上宣布。

以端到端质量和组织诊断标准化的共同愿景为基础，双方此次将合作解决世界各地病理实验室目前尚未得到满足的需求。两家公司的共同目标是通过提供特定技术、产品和服务，来提高病理实验室的标准化水平并实现快速准确的诊断。安捷伦和Visiopharm将合作营销Visiopharm的人工智能病理学解决方案产品系列。

安捷伦科技公司副总裁兼病理学事业部总经理Simon Østergaard表示：“此次合作充分履行了我们抗击癌症的共同承诺。将安捷伦市场lingxian的病理学染色管理解决方案产品组合与 Visiopharm的数字解析解决方案相结合，将有助于改善患者ZL并提高诊断准确性。我们将共同应对病理实验室所面临的一些关键挑战，并为未来实验室的完全数字化铺平道路。”

Visiopharm首席执行官Michael Grunkin表示：“在这一个性化YL蓬勃发展的时代，转向新一代jing准病理学是充分发挥组织病理学潜能的制胜法宝。这一转变需要采用一种贯穿活检到诊断整个过程的一体化标准化方法。我们很高兴能与安捷伦就这方面开展合作。他们的互补产品组合及对此领域创新和zhuo越品质的一贯追求，令人印象深刻。”

这一合作营销关系将有助于提高病理实验室的标准化水平，促进对患者实现准确诊断。尽管当前许多实验室因为缺乏选择和费用高昂而踟蹰不前，但数字病理学仍是未来的发展趋势。此次合作将使实验室能够以灵活、可扩展的方式逐步采纳数字技术。

关于 Visiopharm A/S

Visiopharm^®是人工智能数字化jing准病理学软件领域的ling导者。世界各地的生物制药公司、合同研究机构 (CRO)、学术YLZX和诊断病理实验室均采用Visiopharm的技术进行基于组织的研究和诊断。其解决方案利用人工智能和深度研究的Z新进展，使当今市场可得到Z为准确全面且高度可配置的组织挖掘工具。Visiopharm是一家成立于2001年的私有企业。公司在38个国家/地区共拥有900多份营业许可，业务范围遍及世界各地。公司总部位于丹麦医药谷，并在英国伦敦、德国慕尼黑和美国科罗拉多威斯敏斯特设有办事处。请关注Visiopharm的LinkedIn和Twitter。

关于安捷伦科技

安捷伦科技公司（纽约证交所：A）是生命科学、诊断和应用化学市场领域的ling导者。安捷伦现已进入独立运营的第二十年，一直致力于为提高生活质量提供敏锐洞察和创新经验。安捷伦的仪器、软件、服务、解决方案和专家能够为客户Z具挑战性的难题提供更可靠的答案。2019财年，安捷伦营业收入为51.6亿美元，员工数约为16300人。如需了解安捷伦公司的详细信息，请访问 www.agilent.com。