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- 发给e5r5r 2017-11-21 19:56:22
- GB 4789.3—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》diyi法:大肠菌群MPN 计数法。第二法:大肠菌群平板计数法。两种方法适用于各类食品中大肠菌群的计数。 大肠菌群(Coliforms)是一群在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其存在肠道致病菌的可能性。常以大肠菌群作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 diyi法: 进入无菌操作室前应更换无菌实验服,戴帽子、口罩、无菌手套。进入无菌操作室后,将镊子在酒精灯外焰充分灼烧,夹取适量酒精棉全面擦拭双手,然后才能进行实验操作。酒精易燃,因此在擦拭双手的过程中应离开酒精灯火焰一定距离,防止出现危险,待手上的酒精挥发后,再进行实验操作。 样品的稀释:取一洁净无菌均质袋于自动稀释仪上,将称样勺于酒精灯外焰灼烧片刻,准确称取25g样品于无菌均质袋中。用酒精灯外焰灼烧注水口片刻,在盛有样品的均质袋中注入225mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液。取下均质袋,将均质袋放入拍击式均质器中,用均质器拍打1min~2min,制成1:10的样品匀液。 注意:样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间,必要时可用1mol/L无菌氢氧化钠或1mol/L无菌盐酸溶液调节。均质完毕后,将均质袋置于样品框中。用记号笔依次在无菌试管上做好样品和稀释度标记。用无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入装有9mL生理盐水的无菌试管中。稀释前后试管口都应在酒精灯上灼烧片刻。加塞后于振荡器上混合均匀,制成1:100的样品匀液。根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。稀释样品时,注意吸管或吸头不要触及稀释液面;每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。 初发酵试验:每个样品选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液,每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL。注意,当接种量超过1mL,则用双料LST肉汤,双料LST肉汤是指配置时除蒸馏水外其他成分加倍的培养基。 本次试验中,前三管无菌试管中加入10mL十倍样品稀释液,培养基为双料LST肉汤;第4~6管加入十倍稀释液1mL,培养基为单料肉汤;第7~9管加入百倍稀释液接种1mL,培养基为单料肉汤;接种前后试管口均需用酒精灯灼烧片刻,接种后及时振摇均匀。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。 接种完毕后,将LST肉汤管置于培养箱中36℃±1℃条件下培养24h±2h。24h±2h后,观察试管中的倒管内是否有气泡产生,产气者进行复发酵试验;如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验,未产气者报告为大肠菌群阴性。 复发酵试验:进行复发酵试验时,先将接种环置于红外灭菌器中灭菌,再用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,接种完毕后应及时将接种环在灭菌器中灭菌。将接种完的煌绿乳糖胆盐肉汤管置于培养箱中,36℃±1℃下培养48h±2h。36℃±1℃培养48h±2h后,观察产气情况,若试管中的倒管内有气泡,计为大肠菌群阳性管,否则计为大肠菌群阴性。 四 结果报告 按确证的大肠菌群LST阳性管数,参照GB 4789.3—2010附录中提供的大肠菌群Z可能数检索表,报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。 第二法: 样品处理:固体样品应在无菌条件下充分粉碎。本次演示以乳粉为例,取密封状态良好的试样,备用待测。 检测过程: 在装有9mL生理盐水的无菌试管上做好标记,用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入装有9mL生理盐水的无菌试管中,稀释前后试管口都应在酒精灯上灼烧片刻。加塞后于振荡器上混合均匀,制成1:100的样品匀液。同理,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。稀释样品时,注意吸管或吸头不得触及稀释液面;每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。 接种及培养:在事先经灭菌处理的培养皿底部做好标记。根据对样品污染状况的估计,选取2~3个适宜的连续稀释度。本次演示只做1:10和1:100的样品稀释液。 用无菌吸管吸取1:10样品稀释液1mL,加入到培养皿中,备用。同理,加入1:100稀释液和空白液。注意,每个稀释度应接种2个无菌培养皿,空白液即为以1mL生理盐水代替1mL样品稀释液。 加完样品梯度稀释液后,即可倾倒培养基。倾倒前应将锥形瓶的瓶口在酒精灯上充分灼烧。灼烧后及时倾注15mL~20mL结晶紫中性红胆盐琼脂于每个培养皿中,小心旋转培养皿,将培养基与样液充分混匀。倾注培养基时应将锥形瓶口尽量伸入培养皿内,防止倾倒时培养基挂在培养皿的内壁或外壁上,且倾倒过程应果断,防止培养基沿锥形瓶外壁流出、滴落。培养基的温度以46℃为宜,不能过高或过低,温度过高不利于操作且对菌体有害,温度过低培养基迅速凝固,菌体不能在培养皿内均匀的分布,导致菌落计数困难。转动培养基时用力须均匀,防止培养基沾到培养皿上盖或洒出。 倒完培养基后,静置培养皿,等待培养基冷却凝固。 待培养基凝固后,再加3mL~4mL 结晶紫中性红胆盐琼脂覆盖平板表层。加两次培养基的主要目的是:使菌体均在培养基内部生长,以便于观察典型菌落形态。等待培养基冷却凝固。待培养基凝固后,翻转平板,置于培养箱中于36℃±1℃条件下培养18h~24h。 平板菌落计数:选取菌落数在15CFU~150CFU之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落,其中典型菌落的特征为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm或更大。 证实实验:先在煌绿乳糖胆盐肉汤管上做好标注。将接种环置于红外灭菌器中灭菌,再用接种环从结晶紫中性红胆盐琼脂平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于煌绿乳糖胆盐肉汤管内,振摇均匀。每次接种后都应及时将接种环在灭菌器中灭菌。将接种完的煌绿乳糖胆盐肉汤管置于培养箱中,于36℃±1℃条件下培养24h~48h。培养完毕后,观察煌绿乳糖胆盐肉汤管中产气情况。凡管内倒管有气泡者,即可报告为大肠菌群阳性。 四 结果报告 经Z后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。
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- 食品中脂肪酸检测常见问题
《GB 5009.168-2016 食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》适用于食用油、乳粉等食品中脂肪酸的检测。在开展食品脂肪酸的检测时,实验员经常会遇到各种小问题,小编今天整理了一些常见问题进行分享学习。
\ 脂肪酸甲酯和脂肪酸甘油三酯标准品如何选择?/
国标《GB 5009.168-2016 食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》按照定量方法分为三个方法,分别是内标法、外标法和归一化法。内标法需要使用37种脂肪酸甲酯混标作为定性外标,十一碳酸甘油三酯作为定量内标;外标法需要使用相应的脂肪酸甘油三酯作为定量外标;归一化法需要使用37种脂肪酸甲酯混标作为定性外标。
\ 37种脂肪酸甲酯混标如何使用,
内标法如何配置标准曲线?/
上图为国标GB 5009.168-2016 标准截图,可以看出,内标法需要配置5mg/mL十一碳酸甘油三酯的内标溶液;而混合脂肪酸甲酯标液不需要配置标准曲线,仅用于定性和脂肪酸甲酯响应因子的计算。
如果选购安谱实验的37种脂肪酸甲酯混合标液(CDAA-252795-MIX-1ml,不同浓度于异辛烷,总计10 mg/mL),建议取1.0mL 混合标液稀释至5mL或10mL,得到总计2mg/mL或1mg/mL的37种脂肪酸甲酯混合标准使用液。
内标法的计算公式见上图,可以看出,脂肪酸甲酯混标的作用主要是用来计算脂肪酸甲酯相对十一碳酸甲酯的响应因子,因此进样单点的标准溶液即可;样品中脂肪酸甲酯的含量计算主要取决于样品中添加的十一碳酸甲酯内标的含量和样品中各脂肪酸甲酯的峰面积及其响应因子。样品中脂肪酸的含量需要由脂肪酸甲酯的含量再乘以转换系数得到。
\ 使用CD-2560进样37种脂肪酸甲酯为什么只出了36个峰?/
不同品牌、不同规格的色谱柱,色谱柱污染、柱效下降的色谱柱都可能导致37种脂肪酸的分离有所变化,建议可通过调整流速等参数优化色谱条件,以达到最 优分离度。
建议先在 0.8mL/min 的流速条件下查看目标峰的分离情况,根据出峰情况,如果是 31 号和 32 号峰分离变差就增加流速,如果是 24 号峰、30 号峰和 35号峰分离变差就减小流速,通过流速的微调以找到最 优的分离条件。具体调整方法可查看安谱实验相关的单页“37种脂肪酸甲酯分离的小秘密,你知道吗?”。
\ 外标法检测有哪些需要注意?/
如标准截图所示,外标法使用脂肪酸甘油三酯作为标准品,但需要将脂肪酸甘油三酯标准溶液经过酯交换转变为脂肪酸甲酯上机检测,不可直接将脂肪酸甘油三酯直接上机检测,也不可使用脂肪酸甲酯作为外标进行定量计算。
上图为外标法计算公式,可以看出,外标法是直接计算样品中脂肪酸的含量,不需要计算脂肪酸甲酯的含量。通过脂肪酸甘油三酯的单点外标法进行计算,计算结果主要与脂肪酸甘油三酯标准溶液的浓度、脂肪酸甲酯的峰面积和脂肪酸甘油三酯转化为脂肪酸的系数有关。脂肪酸甘油三酯标准溶液浓度的选择可根据实际样品中脂肪酸的含量进行优化调整,使其尽量接近样品中含量。
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