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PCR相关的问题

蔻笢D茰刑礈 2010-08-10 19:59:28 405  浏览
  • 请各位朋友们帮我分析下 我以前PCR扩增一个基因的CDS,长度1200bp左右,梯度摸好温度Z佳为50度,然后我扩增了20个样本,结果都很好,全部送出去双向测序,序列blast也对了,峰图也挺好的,可是现在再用同一条件就是扩增不出来了,重新摸了温度也解决不了问... 请各位朋友们帮我分析下 我以前PCR扩增一个基因的CDS,长度1200bp左右,梯度摸好温度Z佳为50度,然后我扩增了20个样本,结果都很好,全部送出去双向测序,序列blast也对了,峰图也挺好的,可是现在再用同一条件就是扩增不出来了,重新摸了温度也解决不了问题,体系也进行了优化,dNTP,引物,模板的用量我都进行正交优化了,还是没用。很巧妙的是在一次摸条件(混合模板)的时候56度跑出来了,而且非常亮,紧接着同样条件然后扩增一批,结果目的条带什么都没有,真的不解,稳定咋这么差,我这批模板做了10来个其他基因都是一次就能跑出来,测序结果都很好,模板没问题,这个基因的CDS引物我又重新合成了一次还是不行,所用的酶都试了好几种,MIX也用了,都无济于事。你们觉得我是重新设计引物还是咋的?但是这对引物跑的前面我20个测序结果都出来了,所以不想再换了,真的恼火,请大虾们帮帮小弟 万分感谢 展开

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全部评论(3条)

  • 墩烙肇偈鹤坝 2010-08-12 00:00:00
    估计是你的PCR仪不稳定!

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  • caobaolai1962 2010-08-11 00:00:00
    我觉得Z直接了当的方法还是换引物,这个primer就是不行 如果你还想再继续试的话,可以试试看touch down PCR 从56度逐渐减低到50度 或者用没有扩出来的diyi轮产物再做一轮PCR,像nested PCR一样

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  • 小啦啦gg 2010-08-12 00:00:00
    我觉得根据你说的,就有一种可能啊,就是你的模板降解了。这个基因比较难扩增,所以对模板的要求比较高。引物应该很少降解,而且你以前也做出来了。 我建议你除了引物和模板全部换成你们隔壁实验室的试剂,连pcr仪Z好也用别人的试试,因为什么都有可能坏,而且你trouble shooting的时候没有做positive control,怎么知道不是你的dNTP或者polymerase坏了,所以之后的实验一定要做positive control。如果还不行,重新制备模板,引物一般没有问题,祝你成功 好吧,照你说的,每个环节都没有问题了,那估计是引物的问题了,但是我没有碰到过这样的情况,所以没有感性认识啊,照常理说,什么东西都一样,出来的结果不同,想不通。。。

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一、压力问题

1、系统压力增大:

#判断方法:

①保持泵开的状态,把保护柱的进液口拧开,看一下压力,正常情况下,1.5mL/min流速压力为0或零点几MPa;

②保持泵开的状态,将保护柱的进液口拧上(保证不漏液),将保护柱出液口拧开,看一下压力,正常情况下,1.5mL/min流速压力≤3MPa;——这一步是测试单独保护柱的压力;

③保持泵开的状态,将保护柱的出液口拧上(保证不漏液),将色谱柱出液口拧开,看一下压力;——这一步是测试保护柱和色谱柱的压力;

④保持泵开的状态,将色谱柱出液口拧上,YZ器的淋洗液出口拧开,回流进口和出口都拧开,看一下压力,正常情况下,1.5mL/min流速压力较之前增大值应≤0.4MPa;

⑤然后分别连接YZ器的淋洗液出口→回流进口→回流出口,分别看一下压力。

1a:保护柱压力高

1a-1:清洗或更换筛板:将保护柱取下并拧下柱头,用镊子小心把筛板取下,放入无水乙醇中浸泡并超声清洗10-15min,去离子水冲洗后装上,或者直接更换新的筛板。(筛板图片见图1)

图1

1a-2:清洗保护柱:将保护柱反接后用10倍浓度的淋洗液,0.3 mL/min低流速冲洗,再用正常淋洗液浓度冲洗,然后正接。

1b:色谱柱压力高

1b-1:清洗或更换筛板:将色谱柱取下并拧下柱头,用镊子小心把筛板取下,放入无水乙醇中浸泡并超声清洗10-15min,去离子水冲洗后装上,或者直接更换新的筛板。

1b-2:清洗色谱柱:将色谱柱反接后用10倍浓度的淋洗液,0.3 mL/min低流速冲洗,再用正常淋洗液浓度冲洗,然后正接。

1c:流速设定过高:按照色谱柱分析报告设置流速。

1d:流动相使用不当或有缓冲盐析出:使用优级纯试剂。

1e:进样阀损坏或堵塞:含有固体颗粒的样品堵塞阀体造成压力升高,样品要经过针头过滤器过滤才能进样。

2、压力波动:

2a:流动相气泡干扰:流动相要经过脱气处理。

2b:单向阀处有气泡:开泵,逆时针拧松排气阀,用注射器抽气,待抽出液体之后拔下注射器,观察流出的液体比较均匀,再将泵排气阀拧紧。步骤如图2/3/4

图2

图3

图4

2c:单向阀被污染或者损坏:清洗或更换单向阀。

2d:柱塞杆和密封圈磨损漏液:更换柱塞杆和高、低压密封圈,见图5。

图5

3、压力降低:

3a:流动相气泡干扰:流动相要经过脱气处理。

3b:系统漏液:处理方法见二

3c:流速设定过低:按照色谱柱分析报告设置流速。

3d:柱温过高:按照色谱柱分析报告设置柱温。

4、压力为0:

4a:系统漏液:处理方法见二

4b:泵不吸液:

4b-1:滤头堵塞:察看滤头颜色是否改变,一般情况下污染物会使滤头变色;将滤头取下,用洗耳球吹吸滤头,看气流是否通畅,滤头图片见图6。

处理:将滤头取下放入50mL烧杯中,加入1:1 HNO3或95%乙醇至没过滤头,将烧杯放入超声波清洗器中清洗30min,清洗完确定无问题后,须将滤头用去离子水洗净至中性再安装到流路上。

图6

4b-2:输液泵进液管排除空气

将泵进液管接头拧下,用注射器或洗耳球将管路吸满液体,将水瓶抬高,在管路出液均匀状态下将泵进液管连接到泵上拧紧。

注意:拧接头的是宜松不宜紧,以不漏液为宜。太松容易漏液,太紧会造成管路卡死而不流液或系统压力,造成超压。

4b-3:单向阀处有气泡

开泵,逆时针拧松排气阀,用注射器抽气,待抽出液体之后拔下注射器,观察流出液比较均匀,再将泵排气阀拧紧。

4b-4:单向阀堵塞

取出两个单向阀,放入50mL烧杯中,加入无水乙醇盖过单向阀,放入超声波清洗30min,然后按照1:1的比例加入10%的HNO3(用无水乙醇稀释),清洗5min后,用去离子水将单向阀冲洗干净,重新安装到泵中。(注意单向阀是有方向的,在单向阀中有一个小圈圈,离小圈圈近的一端为液体的入口,如果忘记顺序,可以用洗耳球吹气判断单向阀方向)

4c:保护柱、色谱柱故障:更换保护柱或色谱柱

4d:保险丝断或电源问题:更换保险丝

4e:柱塞杆折断:更换泵的柱塞杆

4f:压力传感器损坏(流动相流动正常,但无压力):更换压力传感器

二、漏液情况

1:接头处漏液

1a:接头处有卡痕松动:切掉PEEK接头的前段变形部分

1b:接头磨损:更换新的接头

2:泵漏液

2a:泵的后冲洗漏液:更换泵的柱塞杆和高、低压密封圈

2b:排气阀漏液:重新拧紧或更换排气阀的密封圈

3:检测器漏液

3a:接头漏液:重新拧紧

3b:侧边漏液:更换新的检测器,同时测试YZ器的压力

三、背景电导高

1、淋洗液基体中有高电导的物质

如水处理不纯或所用的药品不纯,含有其他盐类,经过YZ器YZ后变为相应的高电导值的酸,使电导值居高不下,解决方法:将水重新处理并更换淋洗液。

2、YZ器损坏,无法起到YZ背景电导的作用

更换新的YZ器。

3、电导池中结晶有固体电解质

将电导池取下,滴加一滴1:1的硝酸,再用去离子水冲洗干净。

四、保留时间的变化

1、柱温变化:按照色谱柱分析报告设置柱温

2、流动相组分变化:按照色谱柱分析报告配置淋洗液

3、色谱柱没有平衡:通淋洗液待仪器稳定,约40min

4、流速变化:按照色谱柱分析报告配置流速

5、泵中有气泡:①流动相使用之前要经过脱气处理;② 开泵,逆时针拧松排气阀,用注射器抽气。待抽出液体之后拔下注射器,观察流出液比较均匀,再将泵排气阀拧紧。

五、基线问题

1、基线漂移

1a:温度波动

1b:流动相不均匀(脱气,使用纯度更高的试剂)

1c:电导池被污染或有气泡

1d:流动相配比不当或流速变化

1e:柱子平衡(约30-60min)

1f:流动相污染,变质或由低品质试剂配成

1g:样品中有强保留的物质以馒头样峰被洗出

2、规律的基线噪声

2a:YZ器故障

2b:有地方漏液

2c:流动相、泵、检测器中有气泡

2d:流动相混和不均匀

2e:温度影响(环境温度波动太大)

2f:其他电子设备的影响

3、不规律的基线噪声

3a:流动相污染、变质或由低质溶剂配成

3b:有地方漏液

3c:流动相各溶剂不相溶或混和不均匀

3d:电导池污染

3e:电导池内有毛刺

3f:系统内有气泡

3g:用电导模拟器替代电导检测器,采集基线噪声,若基线噪声大于10,表明电路故障,需要更换电路板。

六、峰形异常

1、鬼峰

1a:进样阀残余峰

1b:样品中未知物

1c:柱未平衡

1d:水污染

2、峰变形

2a:样品过载

2b:样品溶剂选择不当

3、前沿峰、拖尾峰

3a:柱塞板堵塞

3b:色谱柱塌陷

3c:柱外效应

3d:干扰峰

3e:平衡不足或不合适

3f:重金属污染

3g:样品溶剂选择不当

3h:样品过载

3g:柱温过低

4、分叉峰

4a:保护柱或分析柱污染

4b:样品溶剂不溶于流动相

5、峰展宽

5a:进样体积过大

5b:流动相粘度过高

5c:检测池体积过大

5d:保留时间过长

5e:柱外体积过大

5f:样品过载


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