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      众所周知，多功能纳米载体可以有效识别肿瘤细胞并且在体外具有良好的抗肿瘤效果。但是目光转向体内，这些纳米载体往往在免疫系统的攻击下集体失灵。因为，人体免疫系统将会感知纳米载体的入侵，并且非常努力的把我们精心设计的载体清除掉。一旦纳米载体被清除掉，药物就很难到达目标肿瘤区域，很难实现杀伤肿瘤的效果。因此，纳米医学的一个非常重要的课题就是在不破坏免疫系统的前提下，让纳米载体躲避免疫系统的攻击。

      传统的解决方案我们都是通过在纳米载体表面携带各种伪装工具，尽量和免疫细胞捉迷藏，能躲则躲，绝不露面。但是这些载体也很容易迷路， 到达深层肿瘤部位的很少，并且在和免疫系统的斗智斗勇中，还会激发免疫系统产生新的抗体从而加速纳米载体的清除，因此很难达到ZL的效果。而随着仿生纳米医学的发展，科学家们可以让纳米载体穿上“吉利服”，不但可以在免疫系统中潜伏下来，还可以大摇大摆的从免疫细胞的眼皮底下蒙混过关，发挥极大功效。这种“吉利服”就是细胞膜提取物，不同种类细胞提取的细胞膜包覆在纳米载体表面还可以表现出特殊的功效，像红细胞膜或者一些免疫细胞膜可以提高纳米载体的体内循环时间，肿瘤细胞膜可以特异识别同源肿瘤等。穿上“细胞膜吉利服”之后，纳米载体将显现各方面的优势和潜力，从而成为近年来多功能纳米载体领域的研究热点之一。

1、T细胞膜包裹下仿生纳米药物的免疫识别增强

      通过糖代谢技术，获取嵌入叠氮基团（N3）的功能化T细胞，并提取功能化T细胞膜包裹在吲哚菁绿/聚合物纳米载体表面，构建仿生纳米光敏剂。功能化T细胞膜上不但原本的抗原受体可以赋予纳米光敏剂识别肿瘤细胞的能力，并且N3基团可以识别肿瘤细胞糖代谢靶点，从而实现纳米载体在肿瘤内部的富集，通过小动物光学成像可以清楚的看到T细胞膜包裹下仿生纳米药物在肿瘤部位的靶向作用，从而进一步实现肿瘤的jing准可视化ZL。

功能化T细胞膜仿生纳米颗粒实现特异性的肿瘤靶向和jing准光热ZL

参考文献：T Cell Membrane Mimicking Nanoparticles with Bioorthogonal Targeting and Immune Recognition for Enhanced Photothermal Therapy.  Advanced Science. 2019: 1900251.

2、生物学重编程全抗原细胞膜助力纳米疫苗的研发

      将肿瘤细胞和树突细胞融合细胞的生物学重编程细胞膜包覆在金属有机化合物表面，构建肿瘤疫苗可以在融合细胞膜表面表达大量免疫刺激分子，从而使得包裹融合细胞膜的纳米载体像抗原呈递细胞一样直接作用T细胞从而激活免疫反应。通过小动物光学成像，可以看到重编程细胞膜包覆的纳米载体在体内长循环到达肿瘤部位的过程。到达肿瘤部位的纳米载体还可以被树突细胞识别，从而诱导树突细胞成熟，增强免疫效果，Z终消除肿瘤，从而拓展肿瘤ZL平台。

生物学重编程细胞膜包裹纳米载体的过程以及肿瘤免疫的激活

参考文献： Cytomembrane nanovaccines show therapeutic effects by mimicking tumor cells and antigen presenting cells. Nature Communications. 2019, 10(1): 3199.

3、肿瘤细胞膜包裹的黑磷纳米载体拓宽光热肿瘤免疫ZL

      手术切除的肿瘤组织含有对患者特异性的新抗原，是成为制备个体化肿瘤疫苗Z好的材料来源。作者利用细胞膜封装的方式在二维光热黑磷量子点（BPQDs）表面包裹肿瘤组织的细胞膜，从而制备具有光热效应的纳米肿瘤疫苗(BPQD-CCNVs)，并且把纳米肿瘤疫苗和集落刺激因子（GM-CSF）装入热敏水凝胶中。皮下注射水凝胶后可以在红外光的作用下持续释放纳米疫苗以及集落刺激因子，招募并激活DC细胞，从而捕获肿瘤抗原并激活肿瘤特异性T细胞。同时，尾静脉注射PD-1YZ剂，阻断PD-1/PD-L1免疫检查点通路，增强T细胞抗肿瘤免疫应答效应。通过活体光学成像我们可以对肿瘤进行生物发光标记，从而长期连续监测肿瘤在体内的发展情况。实验结果表明通过光热免疫ZL可以有效清除实体肿瘤同时YZ术后转移的复发。

(A)光热肿瘤免疫实验设计思路；

(B)FITC标记的水凝胶在体内的降解情况；

(C)个性化光热肿瘤免疫ZL可以有效YZ术后实体肿瘤的复发；

(D)个性化光热肿瘤免疫ZL可以有效YZ术后肿瘤的转移。

参考文献：Surgical Tumor-Derived Personalized Photothermal Vaccine Formulation for Cancer Immunotherapy. ACS nano. 2019, 13(3): 2956-2968.

珀金埃尔默拥有先进的分子影像技术，其小动物活体成像系统为生物医学的各种研究领域（包括肿瘤、干细胞、传染病、炎症、免疫性疾病、神经疾病、心血管疾病、代谢疾病、基因ZL、纳米材料、新药研发、植物学等）提供了完整的成像解决方案。

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珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

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在上一期IVIS视角中我们和大家分享了IVIS系统如何在活体状态监测植物氮代谢水平，并基于转基因植物开发分子传感器（IVIS系统在植物领域的应用（一）（详情见http://www.yiqi.com/zt2598/news_41438.html），其实除通过构建生物发光的转基因植物之外，IVIS系统还能通过化学发光或者荧光染料探针等方式研究植物领域的多种应用。本期将带领大家继续拓展在植物活体光学领域的应用。

活性氧(ROS)是有氧生物在进化过程中产生的一类含氧基团，具有较高的生物活性。除了作为一种氧代谢副产物会导致细胞氧化应激甚至凋亡之外，随着近年来研究的深入，ROS也被发现参与植物的正常生长进和代谢过程，是许多基本生物过程的关键调节因子，包括细胞增殖分化、器官成熟发育、植物应激抗逆等。在往期分享（点击前方蓝字直达文章内容）中，我们介绍过一种纳米探针用于检测动物体内炎症及肿瘤发生时活性氧水平。而在植物中，虽然许多ROS成像技术已经得到了发展和应用，但目前还缺乏一个动态检测植物体内ROS的植物成像平台。近期出现了一种可靠和直接的方法来对植物中的活性氧进行全植物活体成像，该方法发表在《Molecular Plant》期刊上。

该方法是利用荧光探针的氧化来直接检测ROS，并且研究人员结合IVIS Lumina活体成像系统，开发了一个用于整株植物活体成像的工作流程。通过该工作平台，可以完成荧光染料探针对整株植物的染色、植株刺激处理以及处理后的ROS定量评价。

系统工作流图解说明：

A-B 植物在合适的光照周期和湿度的培养环境中培养

C 植物在玻璃熏蒸箱里用雾状染料熏蒸30分钟

D 植物进行相应的刺激（强光照射、植株损伤、病菌感染）

E 整株植物在IVIS Lumina成像系统中拍摄

F 利用IVIS LivingImage软件分析植株ROS信号

利用该工作平台，研究人员测试了一系列包括DHE、H₂DCFDA、H₂HFF-OxyBURST、Amplex red、SOSG和PO1在内的多种荧光探针，通过整株植物ROS信号积累数据分析筛选出了一个Z有效，Z敏感，能够响应多种外界刺激所产生的ROS的荧光探针——H₂DCFDA，该探针能够表现出Z强的信噪比和应用广泛性。这些不同的外界刺激包括局部强光照刺激、损伤或病原体感染，未来也可以拓展到其他种类的应激反应研究中。此外，通过rbohD和apx1突变体中ROS信号的减弱和增强以及DPI（ROS生产YZ剂）处理后ROS信号传播的减少，进一步证明了该成像系统的有效性，并且表明该方法不受外界因素的影响。

拟南芥在不同外界刺激下30分钟内的ROS积累情况（A 局部强光刺激；D 叶片损伤刺激；G 病菌感染）

这个新方法可用于研究不同遗传变异体的局部和植株整体积累的ROS信号，进行表型分析来发现新的ROS信号通路，监测不同植物和突变体的应激水平，揭示ROS参与到植物应激、生长调节和发育过程的新途径。文章中探讨了这种新方法在不同拟南芥突变体系统以及小麦、玉米等谷物创伤反应研究中的应用。综上，该研究所报道的方法可以快速有效的对植物进行整体的ROS活体成像，这为今后ROS代谢，系统信号传导等的研究提供了十分有利的科学工具。

在往期分享中，我们介绍了IVIS成像系统在动物水平的众多应用，其实IVIS同样可以用于全植物成像。此次我们就分享IVIS在水稻氮代谢研究中的应用。

氮是植物生长发育所必需的养分，但其在土壤中的浓度往往达不到Z佳作物生长浓度。因此，提高作物氮素利用率被认为是农业生物技术的一个主要目标。然而，关于作物氮代谢仍有许多需要了解的地方。

在此，研究人员开发了一个分子传感器系统来监测水稻中氮的状态，该方法发表在《Frontiers in Plant Science》杂志上。研究中首先利用该系统研究了尿囊素的作用，尿囊素分解为尿囊素衍生的代谢物，在低浓度下作为氮源使用。参与尿素代谢的两个基因尿囊素酶(OsALN)和尿素渗透酶1 (OsUPS1)，对氮状态高度敏感，在低氮条件下，OsALN迅速上调，而高氮条件下OsUPS1表达上调。基于上述机制，研究人员培育了含有氮分子传感器系统的[proALN::ALN-LUC2]和[proUPS1::UPS1-LUC2]转基因水稻。这种转基因的表达可以模拟内源性的转录调控，即OsALN和OsUPS1基因对外源N状态的响应。

文中使用两种方法来测定分子氮传感器的能力：

方法一：在长期培养中，转基因水稻植株在高浓度氮源培养基(GM+N)或不含氮源的生长培养基(GM-N)中培养5天，随后使用IVIS活体成像系统进行成像及定量。

结果显示，生长在GM+N培养基中的 proUPS1::UPS1-LUC2 水稻植株表现出更高的荧光素酶活性（图1A）。为了对发光信号进行定量，研究人员测定了5个独立的纯合系（具有单个基因拷贝）。生长在GM+N培养基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株发光信号强于GM-N组20倍，而强于对照组约2,800倍（图1B）。

方法二：在短期培养实验中，转基因水稻植株先在GM-N培养基中培养4天，第5天在加入100nM硫酸铵。结果显示，同长期实验结果一样，生长在后期加 氮培养基中proUPS1::UPS1-LUC2 植株，发光信号更强（图1C）。同样对5株独立的纯合系进行了定量，生长在后期加N培养基中的proUPS1::UPS1-LUC2 植株生物发光信号强于GM-N培养基中约50倍，而强于对照组13,000倍（下图1D）。

图1.在高氮培养条件下，proUPS1::UPS1-LUC2 具有很强的发光信号。

(A)对照组和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM+N或者GM–N培养基 中培养5天；

(B)5个独立的纯合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(A)条件下，发光定量结果；

(C)对照组和proUPS1::UPS1-LUC2 植株在GM–N生长5天, 或者在GM–N培养基中生长4天，然后加入100 mM硝酸铵培养1天；

(D)5个独立的纯合子proUPS1::UPS1-LUC2 在(C)条件下的定量结果，以对照组作为基准进行标准化 。

这些结果说明，proUPS1::UPS1-LUC2 传感器能够通过发光信号水平检测外源氮的情况。

同样在研究中对proALN::ALN-LUC2 植株进行了相同的处理。结果显示，在长时间的培养实验中，GM+N和GM-N培养基生长的proALN::ALN-LUC2 没有明显差异（图2A）。对5株独立的纯品系进行发光信号定量，相比GM+N培养基，GM-N培养基生长的proALN::ALN-LUC2 植株发光信号要高约1.8倍，比对照组高约17倍（图2B）。因此很难鉴定GM+N和GM-N培养基对生长的影响。而在短时间培养实验中，连续生长在GM-N培养基中的proALN::ALN-LUC2，发光信号要强于加高氮培养1天的。

图2.在低氮培养条件下，proALN::ALN-LUC2 植株显示强的生物发光信号。

(A)对照组和proALN::ALN-LUC2 植株，在GM+N or GM–N培养基中培养.；

(B)A组相对定量结果；

(C)对照和proALN::ALN-LUC2 植株在 GM–N中培养5天，或者在GM–N培养基中培养4天，然后加入100 mM 硝酸铵再培养1天 ；

(D)C组相对定量结果；GM–N培养基生长的对照组植株作为基准进行标准化。

此外，在文章中，还利用IVIS活体成像系统，探讨了该传感器对于氮源是否具有选择性及对于氮源的敏感性。结果显示proUPS1::UPS1-LUC2 和proALN::ALN-LUC2 对于氮源无特异性，可以广泛的作为水稻等植株中分子氮的传感器。并且proUPS1: UPS1-LUC2 植株在硝酸铵、硫酸铵或硝酸钾浓度> 1mM即表现出强烈的生物发光信号，而低氮浓度(< 0.01mM)信号减弱。0.1mM硝酸钾proUPS1:: UPS1-LUC2 植株诱导强烈的生物发光信号，而0.1mM硝酸铵和硫酸铵则没有。这表明， proUPS1::UPS1-LUC2 传感器监测高氮状态，低氮状态。proALN::ALNLUC2 在低氮浓度(<0.1 mM)下表现出较强的荧光素酶活性，而在高氮浓度下表现出较弱的活性(> 10mM)。

综上，分子氮传感器的信号反映了分子氮的内部状态。结合IVIS活体成像技术，proALN::ALN-LUC2和proUPS1::UPS1-LUC2 可作为分子传感器在不同研究中监测大米内部氮状态。

文献来源：Dong-Keun Lee, Mark C. F. R. Redillas, Harin Jung, Seowon Choi, Youn Shic Kim and Ju-Kon Kim. A Nitrogen Molecular Sensing System, Comprised of the ALLANTOINASE and UREIDE PERMEASE 1 Genes, Can Be Used to Monitor N Status in Rice. Front. Plant Sci, 18 April 2018.

肿瘤在体内只有一个目标，就是不停地生长！生长！生长！在生长的过程中不可避免的要消耗掉大量的氧气和营养物质，所以肿瘤会构建自身的血管网络系统用于养分和氧气的输送，这些肿瘤内部搭建的血管就是肿瘤的能量供应站。因此切断肿瘤的主动营养供应，破坏肿瘤的能量代谢系统，就能YZ肿瘤细胞的增殖，从而“饿死”癌细胞。

但是，这种能量切断不是广义上的让病人减少进食，或者少吃营养的东西，这样会使正常组织得不到足够的能量导致免疫力下降。真正的饥饿疗法具有选择性，可以特异性的YZ肿瘤细胞的代谢过程（图1），实现对肿瘤的jing准致命打击。

图1 特异性YZ肿瘤细胞能量代谢

级联纳米酶靶向肿瘤“饥饿”环境

通过级联纳米催化药物的设计，将葡萄糖氧化酶(GOx)和过氧化氢酶(CAT)通过pH响应的聚合物交联形成级联纳米酶，通过血清蛋白将纳米酶和抗肿瘤前药复合形成纳米药物。肿瘤的酸性环境可以将纳米酶释放，COx迅速消耗肿瘤细胞内的葡萄糖和氧气，产生饥饿和缺氧环境，切断肿瘤能量供应的同时提升前药系统的化学治LX果，并且消耗葡萄糖产生的毒副产物H₂O₂也可以快速被CAT分解，以避免产生全身毒性。这种结合靶向饥饿环境并结合缺氧化学ZL的方案可以有效YZ肿瘤细胞的增殖，不会产生毒副作用，通过小动物光学成像可以清楚的看到级联纳米酶颗粒在肿瘤部位的富集随时间的变化情况，以及48小时后纳米酶颗粒在各个脏器中的分布情况。

图2 基于级联纳米酶的纳米药物设计以及在体内的靶向分布情况

参考文献

Ma Y, Zhao Y, Bejjanki N K, et al. Nanoclustered Cascaded Enzymes for Targeted Tumor Starvation and Deoxygenation-Activated Chemotherapy without Systemic Toxicity[J]. ACS nano, 2019, 13(8): 8890-8902.

光照诱导肿瘤能量代谢阻断

通过新型纳米颗粒的构建，利用肿瘤细胞高表达组织蛋白酶B的特性，设计酶剪切开关，将载有光敏剂的介孔纳米硅和和定位序列修饰的氧化钨颗粒偶联在一起形成行星-卫星结构。被肿瘤细胞摄取后纳米颗粒可以被高表达的组织蛋白酶B剪切，行星-卫星结构分开，配合不同波段的光照同时引发光动力和光热效应，切断肿瘤氧化磷酸化和糖酵解过程，阻断能量供应，YZ肿瘤的增殖。通过小动物活体光学成像进行肝部转移肿瘤的体内表征，实验结果表明这种纳米颗粒配合光照可以有效诱导肿瘤细胞产生“饥饿”环境，通过YZ肿瘤细胞能量供应清除体内的转移肿瘤。而正常细胞内组织蛋白酶B含量不足，行星-卫星结构无法分开，在光照过程中光动力产生的单线态氧可以进一步氧化纳米氧化钨颗粒，阻碍光热反应的发生，不会影响到正常组织的代谢过程，证实了可以基于能量代谢的肿瘤选择性jing准ZL策略的可行性。

图3 光照切断肿瘤细胞能量供应

参考文献

Huo D, Zhu J, Chen G, et al. Eradication of unresectable liver metastasis through induction of tumour specific energy depletion[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1-17.

早在几十年前，研究者们首次发现，外源的mRNA经肌肉注射至小鼠体内后有相应的蛋白表达，这也成为了mRNA疫苗的雏形。人们一直以来都希望能够生产出一种灵活、易于生产、安全有效的疫苗。而mRNA疫苗就是一种可以满足这些需求的，具有良好的发展前景的新疫苗。而时至今日，在新冠疫情的背景下，mRNA疫苗也不负重望的成为了一颗耀眼的明星，辉瑞、Moderna等公司的mRNA新冠疫苗相继展现出了良好的预防效果，使得mRNA疫苗愈发受到人们的关注。
而合适的mRNA递送载体一直是制约mRNA疫苗发展的一大瓶颈，一个合适的mRNA递送载体可实现对mRNA的GX包载，并在体内实现良好的表达效果。目前常用的几种mRNA递送载体主要包括：聚合物材料、多肽、脂质纳米粒。下面我们就简要介绍一下这几种mRNA递送载体。


（一） 聚合物材料

早期人们采用聚合物材料来进行核酸的递送，如聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）、聚氨基酯（PBAE）、壳聚糖等。大多数用于mRNA递送的聚合物材料都需要进行脂肪酸链的修饰，以改善其安全性，但这些材料的应用目前都只停留在临床前研发阶段。有研究就采用PEI用于将DNA通过吸入的方式输送到肺部。然而PEI不易分解，因此对于可能需要的重复给药，聚合物可能累积并引起副作用。【1】也有研究采用分支型的聚胺基聚合物进行mRNA的包载，构建一套树状聚合物RNA纳米粒，并成功在体内表达出了对抗翟卡病毒、埃博拉病毒的相关抗体。【2】

图1. 麻省理工研究团队采用

聚合物材料制备的mRNA纳米粒【1】

（二） 多肽

也有少量的研究中采用了细胞穿膜肽（Cell-penetrating peptides，CPPs）用于mRNA的递送，如采用包含有两亲性序列精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸（Arg-Ala-Leu-Ala）的细胞穿膜肽来结合mRNA构建成一种CPP-mRNA复合纳米粒，其可以发挥CPP跨越细胞膜的能力，将mRNA很好的递送到细胞内，并引发了良好的T细胞应答。【3】

（三）脂质纳米粒

人们采用离子化的脂质进行siRNA的递送，并在2018年由Alnylam制药公司推出了上市的RNAi药物Onpattro，其就是通过离子化的脂质制备的脂质纳米粒（Lipid nanoparticles，LNPs）进行siRNA的包载和递送。受其启发，目前研究者们也纷纷选择LNPs作为mRNA递送的载体。LNPs主要通过阳离子的磷脂材料与其他辅助磷脂完成颗粒的构建，通过RNA所带的负电与阳离子磷脂的正电相互吸附，可实现较高的包载效果，并且在体内由低密度脂蛋白介导的胞吞机制可使纳米粒子成功被细胞摄取，实现良好的细胞摄取效果。在胞内经由内含体途径将mRNA成功释放，转运到细胞质中进行表达，产生相应的蛋白表达。同时良好的体内安全性也使他更具竞争力，在多种传染性疾病的预防及ZL方面展现出了较好的效果。其中已有大量的研究已经进入了临床研究阶段，如在两项临床一期的流感病毒疫苗研究中，通过LNPs包载核苷酸修饰的mRNA，所产生的机体免疫应答与传统的灭活流感病毒疫苗相似，并且安全性也基本一致。【4】在新冠疫情的背景下，辉瑞与Biotech的mRNA疫苗更是紧急上市，同样采用LNPs作为mRNA的递送载体，并展现出了超过90%的有效率。

图3. 常见的LNPs构造

目前在多种mRNA递送载体中，LNPs还是更优的选择，但是如何开发出新的配方材料，打破相关ZL壁垒，同样是相关研究者争相努力的方向。同时伴随着RNA序列编辑、RNA的大批量快速生产等相关研究的进一步发展，未来mRNA疫苗相关技术会愈发成熟，会引领接下来一段时间的药物研发相关的风潮。
 

参考文献：

1. James Cliff Kaczmarek, Kevin J Kauffman et al.: Optimization of a Degradable Polymer-Lipid Nanoparticle for Potent Systemic Delivery of mRNA to the Lung Endothelium and Immune Cells. Nano Lett 2018, DOI: 10.1021/acs.nanolett.8b02917.

2. Chahal JS, Khan OF, Cooper CL et al.:Dendrimer-RNA nanoparticles generate protective immunity against lethal Ebola, H1N1 influenza, and Toxoplasma gondii challenges with a single dose. Proc Natl Acad Sci USA 2016,113:E4133-4142.

3. Udhayakumar VK, De Beuckelaer A et al.: Arginine-rich peptide-based mRNA nanocomplexes efficiently instigate cytotoxic T cell immunity dependent on the amphipathic organization of the peptide. Adv Healthc Mater 2017, 6.

4. Feldman RA, Fuhr R et al.: mRNA vaccines against H10N8 and H7N9 influenza viruses of pandemic potential are immunogenic and well tolerated in healthy adults in phase 1 randomized clinical trials. Vaccine 2019, 37:3326-3334.

纳米药物制备系统

应用范围：

随着生活水平和YL卫生状况的不断提升，寄生虫感染在我们日常生活中似乎已日渐陌生。但在一些欠发达地区，由于贫困和不良的卫生习惯造成的寄生虫感染仍然威胁着无数生命。隐孢子虫作为一种常见的人畜共患寄生虫感染性疾病，是导致腹泻病的主要原因。由于其经由粪便传播，所以常经由水体污染而在卫生条件较差的地区发生群体性感染。感染通常是自限性的，健康的成年人在发生第 一阶段的较严重的腹泻之后便可恢复，但粪便仍可能具有传染性。新生儿或免疫力低下的如艾滋病患者或经免疫YZZL的病人在感染后病情较严重，是儿童早期死亡、营养不良和生长迟缓的重要原因，也是艾滋病人并发腹泻死亡的主要原因。

现今发现的隐孢子虫共有15个亚种，分别感染人、家禽、宠物、牲畜以及一些野生动物。由于不了解其致病机制，目前的ZL方案往往是对症用药而非对因用药。由于不同物种间感染模式差异，在实验动物(主要为牛等家畜)上应对隐孢子虫感染的有效疫苗往往对预防人的感染收效甚微。

针对以上问题，来自美国宾大兽医学院的研究人员发现了一种可用在小鼠模型中模拟与人患隐孢子虫病相似病症的隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri), 同时利用IVIS小动物活体成像系统帮助他们在体研究隐孢子虫的感染以及宿主经寄生虫或疫苗免疫激活后的抗感染现象。该研究于近期发表在Cell子刊Cell Host & Microbe上。

要在小鼠体内模拟人患隐孢子虫病的合理模型，首先就需要找到相应的隐孢子虫。作者在农场收集了大量小家鼠粪便，经由测序，鉴定出一株与感染人的两种隐孢子虫(C. parvum和C. hominis)Z接近的一种鼠隐孢子虫(C. tyzzeri)。同时为了后续在体观察其感染模式以及宿主抗感染效果，作者通过CRISPR-Cas9技术将Luciferase基因和mCherry荧光蛋白导入到隐孢子虫的基因组中，构建了一株可以进行活体以及显微观察的隐孢子虫。

图一C. tyzzeri的鉴定以及基因编辑 (上：隐孢子虫种间基因组相似性比较，AB为常见感染人的两种隐孢子虫，C为常见感染鼠的隐孢子虫)

构建好的隐孢子虫就可以进行活体观察了，由于有活力的隐孢子虫可以表达Luciferase，在底物荧光素的作用下便可自发荧光，通过IVIS活体成像系统来实时监测体内隐孢子虫的繁殖情况。作者将这一光学观察方式与传统的粪便qPCR检测结果进行验证，二者具有很好的一致性。作者除了观察到这一新鉴定的隐孢子虫感染和人患隐孢子虫病的感染部位以及病理表征一致之外，还观察到了具有免疫缺陷的鼠(IFN-γ、Rag基因的敲除鼠 )也更易受到隐孢子虫的危害，这一点与临床上免疫缺陷病人的高发病致死率也刚好吻合。

图二  C. tyzzeri感染模式观察

有了这一能够很好模拟人隐孢子虫感染的实验动物模型之后，便可以利用这一模型进行隐孢子虫的ZL以及疫苗的开发。由于临床上隐孢子虫高发地区人们在感染痊愈后再度感染的概率大大降低，因此作者首先检验了虫体是否可以直接作为疫苗来进行感染的预防。利用未经Luciferase标记的C. tyzzeri进行第 一次感染，同时实验组使用灭活的虫体作为疫苗进行第 一次免疫，在感染后用广谱抗虫药巴龙霉素杀灭后用Luc标记C. tyzzeri进行二次感染，能够观察到接触活虫的小鼠几乎不会发生二次感染，而使用灭活虫体作为疫苗无法激活体内免疫系统进行后续的抗感染作用。

图三 使用灭活的C. tyzzeri无法预防感染

因此作者想到可以使用减毒的活虫对宿主进行第 一次免疫。通过射线进行寄生虫减毒处理，可以降低其感染力至无害水平。在减毒活虫感染后30天，在使用Luc标记的C. tyzzeri进行感染，能够观察到该方法与野生型活虫二次感染模型有着相同的抗感染作用，说明减毒的疫苗是一种行之有效的预防隐孢子虫感染的方式。但是由于要调动自身免疫系统，这一方法在免疫缺陷的小鼠身上仍不奏效。

图四 使用减毒疫苗可以有效对隐孢子虫进行预防

虽然这篇文章也并未真正解决隐孢子虫的抗感染问题，但是构建出针对这一寄生虫病的实验小鼠模型已经为后续的科研工作者尝试更多ZL方案和预防措施提供了可操作可监控的实验工具。

参考文献

1. A Genetically Tractable, Natural Mouse Model of Cryptosporidiosis Offers Insights into Host Protective Immunity. Adam Sateriale et al., 2019, Cell Host & Microbe 26, 1–12

https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.05.00

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肿瘤异质性及转移性

人类大多数肿瘤是异质性的，由具有不同性质的细胞克隆组成，呈现出不同的特点。高度异质性肿瘤具有较差的临床LX，但其潜在机制仍不清楚。肿瘤的转移性是大多数癌症患者死亡的原因。因此，了解转移进程的驱动因子是改善临床结果的关键。

癌症基因组测序研究已经确定了原发性和转移性肿瘤之间具有极小的遗传差异，并显示原位肿瘤和远处转移病灶具有显著的亚克隆异质性。Z近的一些研究表明：微观环境变化是肿瘤转移传播和生长的主要媒介，从而突出了在肿瘤进展中的非细胞自发因子的作用。

本期IVIS视角小编带您探究一下NatureZ近发表的论文：《亚克隆合作通过修饰局部和全身的免疫微观环境驱动肿瘤转移》

本文揭示了表达IL11和FIGF (VEGFD)的乳腺癌细胞的小亚克隆协同作用促进转移进展并产生了驱动性和中性亚克隆组成的多克隆转移。单克隆、多克隆原发灶和转移灶的上皮细胞及基质细胞表达谱分析显示了这种协同作用是间接的，是通过局部和系统微环境介导的。作者确定中性粒细胞为主的白细胞群受表达IL11小亚克隆的调节，敲除中性粒细胞的表达，可以阻止肿瘤转移的生长。来自原发性肿瘤、血液和肺的CD45阳性细胞群的单细胞RNA-seq显示IL11作用于骨 髓间充质基质细胞，可诱导产生致瘤性和转移性中性粒细胞前体。本文结合IVIS活体成像系统研究发现了非细胞自发因子和小亚克隆在肿瘤转移中起着关键作用。

探究驱动转移的亚克隆协同作用分子机制

本文用人类乳腺癌细胞系(MDAMB-468)的肿瘤（来源于异质性肿瘤异种移植模型），研究亚克隆在肿瘤表型之间的相互作用。作者之前已经证实一个小的亚克隆通过非细胞自主的相互作用可以驱动肿瘤生长。本文测试了18个亚克隆，每一种表达一种与转移和血管再生有关的分泌蛋白。并发现具有全部18个亚克隆的多克隆肿瘤生长Z快（上图a）。相反只有白细胞介素11 (IL11) 和趋化因子 (C-C motif) 配体5在单克隆肿瘤能够促进肿瘤生长。我们还确定了表达IL11和低聚果糖诱导生长因子（FIGF也被称为VEGFD）的亚克隆两者的混合物在很大程度上能够复制肿瘤这种生长特点。

克隆之间合作导致多克隆转移

Nature Cell Biology :Published: 01 July 2019

https://www.nature.com/articles/s41556-019-0346-x

IL11缺失的多克隆肿瘤阻止了肿瘤的生长，揭示了IL11和FIGF因子在肿瘤生长中的协同作用。此外，多克隆肿瘤和仅包括IL11和FIGF亚克隆的肿瘤具有高度的转移性（上图b）。

本文首先验证含有IL11+和FIGF+驱动因子的原发性转移瘤MDA-MB-468的克隆能力，像中性子亚克隆。单克隆或绿色荧光蛋白 (GFP)的多克隆混合物荧光素酶表达亲本细胞，红色荧光蛋白 (RFP)植入v5标记的IL11+细胞、RFP+FIGF+细胞植入到免疫缺陷NOG小鼠的乳腺脂肪垫。我们每周用卡尺测量原发肿瘤的生长情况并通过每周生物发光观察转移病灶成像。多克隆肿瘤（含5% IL11+、5%的FIGF+RFP+细胞和90%的GFP+亲本细胞）生长较快，转移性更强与单克隆和亲本肿瘤相比（如下图a）。

中性粒细胞的系统性表达降低YZ了由IL11+和FIGF+亚克隆驱动的多克隆肿瘤的转移扩散(或生长)，因此，中性粒细胞的表型和功能特点取决于宿主环境。

CD45+细胞群的单细胞分析

鉴于作者之前的结果表明，中性粒细胞促进肿瘤转移。作者比较了DOX+或DOX-诱导小鼠血液和肺中性粒细胞单细胞转录组特点。IL11和FIGF诱导上调了几个信号通路如：TGFβ和JAK-STAT信号通路，它们与中性粒细胞的免疫系统中肿瘤预生成和预转移有关，这些特征来自肺部，而不是来自血液。尽管中性粒细胞在肺部有变化，作者通过single-cell RNA-seq没有检测到IL11或GIGF受体的表达。然而，IL11RA的细胞转录本在单独的细胞组中明显存在，这些细胞不能归为中性粒细胞或其他白细胞亚群。

这些IL11RA阳性细胞表达编码GP130和SATA3的IL6ST基因，GP130是IL11信号通路中所必需的共同受体。STAT3是LI11下游的作用因子。基于细胞群中基因表达情况，其中还包括细胞外基质和发育相关蛋白，作者将该群体标记为和IL11反应的间充质基质细胞 (MStrCs)。虽然这个群体没有表达典型的间充质干细胞 (MSC)标记物，但其表现了普遍存在于干细胞相关基因的显著特征，这表明它可能是一种未特征化的间充质干细胞前体。之前的研究已经描述过间充质干细胞与白细胞之间的相互作用由多种细胞因子和趋化因子调节的。

在本文的研究中，作者着重于研究两个分泌因子，选择的基础是基于作者之前的数据，它是由较小的亚克隆表达的且协同作用促进转移。IL11属于IL6家族的细胞因子，并在多种癌症的耐药性进展中起着重要的作用，包括前列腺癌和结肠癌。在乳腺癌中，IL11被认为和ZL的耐药性和骨转移相关，以及作为不良预后的标志物。FIGF是VEGFR2和VEGFR3的配体，可以刺激血管生成和淋巴管生成。

本文发现白细胞可能不是IL11直接作用的细胞靶点，但可通过间充质基质细胞分泌因子（MStrCs）间接影响IL11。有趣的是，这些基质细胞也表达PLXDC2和ANTXR1，这在肿瘤相关的内皮细胞中是高表达的。因此，这些IL11RA阳性的间充质基质细胞可能是产生多种细胞类型的祖细胞。对中性粒细胞亚型的进一步认识和开发导致肿瘤转移的中性粒细胞靶向工具结合抗肿瘤细胞靶点的药物，有可能被用于预防乳腺癌转移研究。

PerkinElmer IVIS小动物活体成像系统在该研究中提供了支持，如需了解详情欢迎与我们的工程师取得联系。

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      癌症导致的死亡中，大部分是由恶性肿瘤转移而引起的，在临床上仍然是一个挑战。转移性癌细胞通常与原发癌细胞相似，但它们可能会受到所转移器官附近环境的影响。本文揭示了结直肠癌(CRC)细胞在转移至肝脏(一个关键的代谢器官)后经历代谢的重组过程。特别是肝转移细胞通过GATA结合蛋白6抗体 (GATA6) 上调醛缩酶B (ALDOB)的表达，提高果糖代谢，为肿瘤细胞增殖过程中的主要ZX碳代谢提供能量。靶向ALDOB或降低膳食果糖可显著降低肝转移性生长，但对原发肿瘤几乎没有影响。本文的研究结果表明，转移细胞可以在新的微环境中利用代谢重组，尤其是在代谢活跃的器官，如肝脏中，对相关通路的操纵可能会影响转移性生长的过程。

      原发性肿瘤逐渐累积遗传性改变，并受其肿瘤微环境的影响，直到获得能转移到远处器官的能力(Gupta和Massague, 2006;Valastyan和Weinberg, 2011)。这一过程的典型特征是，结直肠癌（CRC）经过腺瘤到癌的顺序发展，Z终导致转移(Barker et al.， 2009)，(约70%的患者) 优先转移到肝脏这个部位 (Rothbarth和van de Velde, 2005) 。在这个阶段，该疾病变得很难ZL，并对大多数形式的联合ZL产生耐药性，使得结直肠癌（CRC）转移成为癌症相关死亡的主要原因。无法进行手术的肝转移患者对化疗干预治LX果较差，中位生存期为6至9个月 (Alberts et al.， 2005) 。目前针对晚期结直肠癌的化疗并不针对肝转移。部分原因是由于观察到CRC转移与任何特定的基因突变并不一致 (Jones et al.， 2008) ，而且它们通常与原发肿瘤中的细胞相似。然而，新出现的证据表明，非遗传改变，如表观遗传和代谢重组，可能促进癌症转移。将这种机制作为研究的目标可能为开发结直肠癌转移的ZL方法提供新的途径。

      在本研究中，来自临床样本和经盲肠移植的体内CRC转移模型的数据表明，结直肠癌（CRC）肝转移瘤的特定代谢通路发生了改变。特别是，肝转移会上调ALDOB的水平，这是一种参与果糖代谢的酶。肝内植入表明肝环境导致CRC细胞上调ALDOB。代谢组学和13C标记的果糖追踪研究表明，ALDOB促进果糖代谢，促进糖酵解、糖异生和戊糖磷酸途径。降低ALDOB或限制饮食果糖会YZCRC肝转移瘤的生长，但不YZ原发肿瘤或肺转移瘤的生长，这突出了肿瘤微环境的重要性。

1、在结直肠癌CRC肝转移中BALDOB表达升高

      为了证实ALDOB在肝转移中的上调，作者将3株CRC细胞株：HCT116和2株肝转移患者来源的异种移植(PDX)细胞株CRC119和CRC57植入NOD/SCID小鼠的盲肠末端。细胞携带双标记报告基因结构，稳定表达荧光蛋白(mCherry或GFP) 和荧光素酶。在盲肠注射前，流式细胞分选(FACS)分析显示，这些CRC细胞株中KHK、ALDOB和HK表达均为单峰。注射盲肠后，CRC细胞在2周内首次形成原位肿瘤。随后，它们在5周内发生了CRC肝转移。收集原发性盲肠和肝转移肿瘤后，利用荧光流式细胞仪(FACS)分离CRC细胞。肝转移瘤的ALDOB水平明显高于原发性转移瘤，而KHK和HK水平基本保持不变(图3B-3D) 。20%至40%的小鼠也出现肺转移，尽管与原发性盲肠肿瘤相比，肺转移中ALDOB没有上调。

Figure 3. 肝转移使体内ALDOB表达升高

      为了研究肝脏微环境是否引起CRC细胞中ALDOB的表达上调，本文将HCT116、CRC119和CRC57细胞同时直接注入小鼠肝脏和盲肠。CRC肿瘤迅速在肝脏和盲肠中形成，注射10天后，分别采集肿瘤。肿瘤经盲肠转移至肝脏之前，在盲肠注射模型中需要3~5周(图3E)。从采集的肿瘤细胞中，利用荧光流式细胞分选(FACS)分离出CRC细胞。Western blot检测证实，从肝脏分离的CRC细胞中ALDOB水平高于盲肠分离的细胞，而KHK和HK水平保持相似(图3F-3H)。另一方面，Transwell迁移实验中迁移和非迁移的CRC细胞表达了相似的ALDOB水平，这表明ALDOB与迁移能力的增强无关。此外，在体外培养后，肝脏和盲肠分离的肿瘤细胞表达相似的ALDOB水平。综上所述，这些数据表明肝脏微环境可导致CRC细胞上调ALDOB的表达。

2、ALDOB促进CRC肝转移瘤的生长

      HCT116、CRC119和CRC57细胞中ALDOB 的表达下调（RNA干扰下调表达），不影响体外含葡萄糖或果糖培养基中培养的CRC细胞迁移 。尽管盲肠移植HCT116、CRC119或CRC57细胞与对照载体均可有效发展肝转移(3个细胞系的5只小鼠中有5只发生了转移) ，但在盲肠注射模型中，ALDOB下调表达可YZCRC肝转移。经shRNA1干扰的ALDOB的HCT116、CRC119或CRC57细胞分别在5只小鼠中仅有2只、2只和2只出现可检测到的肝转移，而经shRNA2敲除的小鼠分别为2、1和2只(图-5E) 。此外，从ALDOB 下调表达细胞中的肝转移比对照细胞中的肝转移肿瘤少得多，且小得多。然后进行肝内注射，观察ALDOB是否促进肝内CRC的生长。对照载体的HCT116、CRC119和CRC57细胞在肝脏中生长明显大于ALDOB表达下调的细胞(图5F-5H) 。

Figure 5. RNA干扰ALDOB表达可YZCRC肝转移

3、靶向果糖代谢YZ肝转移

      接下来考虑的是，果糖摄入量的水平是否会影响肿瘤的生长，尤其是在肝脏。注射CRC至盲肠后 (每组5只小鼠) ，高果糖饮食的小鼠显示CRC肝转移增加，而不含果糖饮食的小鼠相对于对照组显示肝转移减少(图6A-6D) 。随后将这两种ZL方法结合起来。对小鼠注射ALDOB基因敲除剂后，然后按规定对其喂食不含果糖的饮食。这正如预期的那样，YZ了CRC的肝转移(图6A-6D) 。将CT26细胞注射到具有免疫功能的BALB/c小鼠的盲肠中，在果糖饮食对肝转移瘤的影响方面也显示出类似的结果。一直以来，高果糖饮食降低了老鼠的存活率，而低果糖饮食和低碳水化合物能延长老鼠的存活率。

用相同shRNA结构转染LV-HCT116细胞，下调ALDOB的表达。与盲肠注射模型一致，ALDOB下调表达和果糖限制饮食YZ了肝脏中CRC肿瘤。关于YZ肝脏LV-HCT116肿瘤，ALDOB下调和果糖限制似乎比5-氟尿嘧啶或奥沙利铂更有效，这两种药物都是晚期和转移性CRC的一线化疗。与ALDOB敲除或果糖限制饮食不同，5-氟尿嘧啶或奥沙利铂在肿瘤YZ或生存方面几乎没有益处。因此, 针对ALDOB和果糖代谢的调节可能会影响肝转移瘤的生长，并对目前的化疗作为一个补充策略。

Figure 6. 饮食果糖限制YZCRC肝转移

结论

      目前的结直肠癌（CRC）化疗无法区分转移部位。然而，CRC细胞从结肠迁移到肝脏后，可能需要适应肝脏的代谢环境。本文证明转移的CRC细胞有能力适应其转移器官的营养变化。转移性CRC细胞上调肝脏中的ALDOB，从而促进果糖代谢，促进ZX碳代谢。RNA干扰ALDOB或对果糖饮食限制会YZCRC肝转移。得益于活体成像技术的长期、连续的活体检测的优势，靶向果糖代谢是ZLCRC肝转移的一个潜在令人兴奋的策略。也希望Perkinelmer的活体成像技术为更多疾病模型的开发，代谢通路的研究等带来更多的帮助。

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