仪器网（yiqi.com）欢迎您！

一、DNA 甲基化概述

表观遗传学是研究 DNA 序列不发生改变的前提下，基因的表达发生可遗传变化的一门学科。表观遗传修饰的研究内容包含 DNA 甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、ADP-核糖基化等。DNA 甲基化是人类最 早发现的表观遗传修饰之一，属于非组蛋白表观遗传现象。DNA 甲基化是指在 DNA 甲基转移酶（DNA Methyltransferase，DNMTs）的催化下，将一个甲基（CH3）基团共价连接到胞嘧啶的 5 号碳原子上，形成 5-甲基胞嘧啶（5mC）的过程。哺乳动物体细胞的 DNA 甲基化主要发生在 CpG 岛（CpG islands，C 指胞嘧啶，G 指鸟嘌呤，p 指连接 CG 碱基的磷酸）。研究结果表明，基因调控元件（如启动子）的 CpG 岛发生 5mC 修饰会在空间上阻碍转录因子复合物与 DNA 的结合。因而 DNA 甲基化一般与基因沉默相关，非甲基化一般与基因的活化相关，而去甲基化一般与沉默基因的重新激活相关。

细胞的表观遗传修饰与细胞代谢、癌症、衰老、心血管疾病及神经退行性疾病等多种疾病相关。受环境，疾病，性别和年龄等因素影响，DNA 甲基化水平处于动态的变化过程。不同个体、组织与细胞之间，甚至是同一个体或细胞的不同发育时期，DNA 甲基化的程度和状态都可能存在差异。研究表明，DNA 甲基化在基因调控、蛋白质表达、胚胎发育、细胞分化、X 染色体失活以及疾病和肿瘤的发生、发展等过程中起重要的调节作用。

二、DNA 甲基化的常见检测方法

DNA 甲基化具有重要的生物学功能，科学家们开发了大量的方法检测 DNA 甲基化水平。目前常见的 DNA 甲基化测定方法包括以下几类：

1. 基因组甲基化水平的分析方法：

包括高效液相色谱（HPLC）和高效毛细管电泳法（HPCE）。

2. 候选基因甲基化分析方法：

包括甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法（MSRE-PCR/Southern）、重亚硫酸盐测序法（Bisulphite Sequencing）、甲基化特异性的 PCR（MS-PCR）、甲基化荧光法、焦磷酸测序（Pyrosequencing）、以及结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（COBRA）等。

3. 基因组范围的 DNA 甲基化模式与甲基化谱方法：

包括限制性标记基因组扫描（RLGS）、甲基化间区位点扩增（AIMS）、甲基化 CpG  岛扩增（MCA）、差异甲基化杂交（DMH）、由连接子介导 PCR 出的 HpaII 小片段富集分析、以及甲基化 DNA 免疫沉淀法等。

三、使用微孔板读板机测定 DNA 甲基化

1. DNA甲基化检测

DNA 甲基转移酶催化甲基基团共价连接到胞嘧啶的 5 号碳原子上，形成 5-甲基胞嘧啶（5mC），5mC 是最 早被发现，也是研究最多的修饰碱基，在基因表达调控、生物生长发育和疾病发生等过程中发挥重要作用。5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是在哺乳动物胚胎干细胞和人、小鼠脑细胞中表达的一种修饰，它可以把胞嘧啶羟甲基化。DNA 甲基化水平是一个 DNA 甲基化和 DNA 去甲基化的动态调控的过程。研究结果表明，5mC 可以导致基因沉默或基因表达水平降低，而 5hmC 作为去甲基化过程的第 一步，会导致基因激活或基因表达水平升高。分析 5mC 和 5hmC 在不同细胞和基因组不同区域的含量和比例，对于确认健康和疾病的细胞/组织中的甲基化修饰变化具有重要意义。高效液相色谱法（HPLC）， 薄层色谱法（TLC）和质谱等基于层析的技术都可以被用来检测 5mC 和 5hmC，但是它们步骤复杂，耗时，且成本较高。

利用微孔板读板机（酶标仪）进行 DNA 甲基化相关实验测定灵敏度高，特异性好，并且整个操作步骤简易，快速。可以利用 Molecular Devices 酶标仪，结合 DNA 甲基化检测分析试剂盒，通过光吸收法或荧光法定量检测不同样本的甲基化 DNA（5mC）和羟甲基化 DNA（5hmC）。

2. DNA 甲基转移酶检测

DNA 甲基化是表观遗传学的重要部分，DNA 甲基化模式的改变会导致肿瘤及多种疾病的发生，例如在很多肿瘤中都发现 DNA 甲基转移酶（DNMTs）的表达异常。对 DNA 甲基转移酶的研究不仅可以揭示 DNA 甲基化对基因表达调控的机制，对肿瘤等疾病的治 疗也具有潜在意义。

作为甲硫氨酸的活性形式，s-腺苷甲硫氨酸（s-adenosyl-methionine，SAM）在生物体内的各种代谢过程中起重要作用，参与催化人体内多种不同甲基转移酶，并且与多种甲基转移酶的活性密切相关。SAM 作为甲基供体，在甲基转移酶的催化作用下，可以将甲基基团转移到相应底物上，随后生成 s-腺苷高半胱氨酸（s-adenosyl-l-homocysteine，SAH）。甲基转移酶通用酶活评价分析方法就是利用这一特性，通过检测 SAH 的含量变化，从而评估催发反应中甲基转移酶的活力和反应效率等。

Elisa 作为传统的方法，存在实验步骤多，需要经过多次洗板、加样、显色等操作步骤，耗时长，结果不稳定等不足。可以利用 Molecular Devices 酶标仪，结合均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF）的方法检测甲基转移酶，这种检测方法适合几乎所有甲基转移酶和底物的检测，操作步骤简单、灵敏度高且无放射性污染。

优势

• 拥有 HTRF 兼容性认证，确保仪器性能 

• 高度稳定、均质的高通量检测 

• 使用 SoftMax Pro 软件更快地获得结果

参考文献：

[1]Kelly T K, Carvalho D D, Jones P A. Epigenetic modifications as therapeutic targets [J]. Nature Biotechnology, 2010, 28(10):1069-1078.

[2]Bird, Adrian P. CpG-rich islands and the function of DNA methylation [J]. Nature, 1986, 321(6067):209-213.

[3]Jaenisch E. Role for DNA methylation in genomic imprinting [J]. Trends in Genetics, 1994.

[4]Cedar, H. DNA methylation and gene activity [J]. Annual Review of Biochemistry, 1988, 53(1): 3-4.

[5]Razin A, Riggs A D. DNA methylation and gene function [J]. Science, 1980.

[6]Kovalchuk I. Role of DNA methylation in genome stability [M]. 2021.

[7]Dai W, Liu J Q. The Progress on Detection Methods of DNA Methylation [J]. Biological Chemical Engineering, 2018.

[8]Yuan-Yuan L I, Gong X, Bao Y F, et al. Research Advances of DNA Methylation and Its Detection Methods [J]. Hunan Agricultural Sciences, 2010, 49:15-17.

[9]Bioassays C, Codolet, Roux T, et al. Automation of a HTRF Universal Methyltransferase Assay.

DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

Nature上一项新的研究揭示了一种跨染色质调节途径，即NSD1（一种组蛋白甲基转移酶）介导的H3K36me2是在基因间区域招募DNMT3A和维持DNA甲基化所必需的，并将异常的基因间CpG甲基化与人类肿瘤生长和过度发育相关联在一起。

作者发现了一个有趣的现象：塔顿布朗拉赫曼综合征(Tatton–Brown–Rahman syndrome, TBRS)是一种儿童过度生长障碍，是由生殖系统DNMT3A（DNA甲基转移酶3A）突变导致的。儿童期巨脑畸形综合征(Sotos syndrome)是由NSD1（组蛋白甲基转移酶）的单倍剂量不足引起的。这两种疾病具有相同的临床特征，这就非常有意思了：这预示着组蛋白修饰和DNA甲基化修饰可能存在机制上的关联性。

首先，研究人员通过全基因组分析和ChIP-seq分析方法发现，组蛋白甲基化修饰H3K36me2和H3K36me3的富集区域非常类似，且明显区别于其他组蛋白甲基化修饰如H3K9me3和H3K27me3所划分的区域。而且H3K36me2和H3K36me3水平与CpG甲基化呈正相关，这与之前报道的H3K36me3介导靶向DNMT3B的活性一致。然而，由于这种相互作用于基因小体，染色质水平上的调控机制并不清楚。

在进一步的检测和比较全基因组分析，发现H3K36me3在基因体中表现出特征性的富集，而H3K36me2则表现出更为弥散的分布，包括基因区和基因间区。与H3K36me3相比，DNMT3A选择性富集在H3K36me2高水平区域。

接下来，就是我们的独 家法宝Alpha技术大显身手的时候了。研究人员采用体外高灵敏度、匀相免疫AlphaLISA技术来阐明H3K36me2介导的DNMT3A募集特异性背后的机制。首先GST标记DNMT3A，纯化后将GST-DNMT3A与生物素化的核小体（不同甲基化的H3K36）置于384孔板。依次加入谷胱甘肽受体微珠，链霉亲和素供体微珠。避光反应60min后置于Envision多模式读板仪中对信号进行检测。

通过亲和曲线分析可得知，DNMT3A与H3K36me2修饰的核小体的亲和力Z高，其次是H3K36me3，但不与其他价态结合。这些结果表明DNMT3A可以识别H3K36两种甲基化状态，但对H3K36me2的亲和力更强。

同时，作者也在体外NSD1突变细胞和临床Sotos综合症病人的血样本中验证组蛋白H3K36甲基化与DNA甲基化修饰的相关性，揭示DNMT3A优先选择H3K36二甲基化区域，促进基因间区的DNA甲基化。这一机制在疾病发生过程中有潜在的生物学意义。

珀金埃尔默公司一如既往的为用户提供客制化Alpha Assay检测试剂和高品质的检测设备：

EnVision多标记微孔板读板仪

识别二维码获取详细产品信息

EnSight多标记微孔板读板仪

识别二维码获取详细产品信息

Victor Nivo多标记微孔板读板仪

识别二维码获取详细产品信息

参考文献

Weinberg D N, Papillon-Cavanagh S, Chen H, et al. The histone mark H3K36me2 recruits DNMT3A and shapes the intergenic DNA methylation landscape[J]. Nature, 2019, 573(7773): 281-286.

Dor Y, Cedar H. Principles of DNA methylation and their implications for biology and medicine[J]. Lancet. 2018