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细胞冻存

       细胞冻存是指将细胞放在低温环境，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用。

细胞冻存流程示意图

       目前，细胞冻存主要的技术为液氮冷冻法，实际冻存过程中，需要进行梯度温度冻存，并加入适量的保护剂以保证细胞内外的水分不会形成冰晶造成细胞的损伤或死亡。

什么时候可以冻存细胞

       在准备对目标细胞进行冻存前，一定要确保细胞处在Z佳的生长状态，可通过以下几个指标进行观测：

1 培养基的颜色和浑浊情况

       培养基的颜色可以指示细胞是否生长过盛（比如偏黄就说明细胞长的太过）；而培养基出现浑浊情况往往是指示有污染存在，此时是不宜冻存的。

2 细胞培养的时间

       通常情况下，新复苏的细胞建议在2周左右进行冻存，若连续培养超过二个月，性状大概率会发生一些改变，此时的细胞也不适宜冻存。

3 细胞的数目

       冻存时，每只冻存管内细胞Z佳浓度为5x10^6个/ml—1x10^7个/ml，高密度或者低密度对细胞成活率都有一定的影响。细胞数目不足时，不建议冻存细胞。

细胞冻存前需要做什么预处理吗

       细胞被消化离心、去上清收集细胞沉淀后，往往需要用冻存液进行重悬并转移至冻存管。冻存液中一般含有渗透型的保护液如甘油或10%的二甲基亚砜（DMSO）和10%-90%胎牛血清。

       细胞内外主要成分都是水，若不加保护液直接冻存，细胞内外的水分会凝结成冰晶，引发细胞内源性的机械损伤。细胞内水分凝结导致的细胞脱水，也会使得胞内pH值改变、蛋白变性、细胞内器官功能的丧失乃至核内DNA损伤，Z终 极有可能导致细胞的死亡。

       而冻存液往往都是易溶解的小分子物质，具有细胞渗透性，可以穿过细胞膜，进入细胞内，降低冰点，同时又可以提高细胞膜对水的通透性，使得细胞内水分渗出到细胞外，从而减少细胞内冰晶的形成。

       *某些特殊细胞如原代皮肤细胞也会额外添加海藻糖等表面型保护剂，以提高细胞存活率。

       *由于DMSO对大部分细胞无毒性作用，因而在细胞冻存液中被广泛使用；也有少部分细胞部分细胞对DMSO毒性敏感，可以选用甘油作为冻存保护剂。

       冻存液中的另一个主要成分是胎牛血清。由于冻存中的细胞仍旧有微弱的新城代谢，在冻存液中加入血清，可以为细胞提供营养。同时，血清中富含的蛋白等大分子物质可以对细胞有较好的保护作用。实验证明，血清在冻存液中的高比例，有利于提高细胞活力。因而，在冻存过程中可以使用90%的血清加上10%的保护液进行细胞保存。对于常见的易培养细胞系10%到20%的血清再加上一定量的完全培养基和DMSO也可以很好的对细胞进行保存。

细胞冻存的降温过程是怎样的

       细胞冻存过程是一个梯度降温的过程，而其Z终储存的Z佳保冷介质为液氮。液氮的温度可以低至-196℃，在这种低温条件下，细胞的保存理论上是性的。

       缓慢冻结的过程，能使细胞内水分在冻结形成冰晶前透出细胞，因此梯度降温可以大大减少细胞在降温过程中受到的损伤。目前，实验室通用的梯度降温方法以下两类：

1 人工传统降温法

       冻存管置于4℃ 10 min → -20℃ 30 min → -80℃ 16-18 小时（或过夜，Z长放置时间不要超过一个月）→ 转移至液氮长期储存。

       *细胞置于4℃及-20℃的时间不可太长，且从4℃转移至-20℃时，Z好颠倒混匀下细胞，防止细胞大量沉降堆积至管底，影响细胞复苏。

2 借助冻存盒、细胞渐冻仪等工具

       利用其中的介质特性或制冷程序进行自主梯度降温：

       冻存管置于细胞冻存盒（冻存盒需要提前预冷至4℃，需检查其内异丙醇或其他液体是否足量）后放于-80℃冰箱16-18 小时（或过夜，Z长放置时间不要超过一个月）→ 转移至液氮长期储存。

       冻存管置于渐冻仪中以1-2℃/min的降温速率降至-100℃后，→转移至液氮长期保存

使用液氮罐的安全小提示

       液氮（Liquid nitrogen）是液化的氮气，是生命科学研究和医药行业常用的冷冻储存介质，具有以下理化性质：

       01 超低温性：液氮的沸点为－195．8，液氮气化时每公斤可吸热 48 大卡；

       02 无色、无臭、无毒的液体；

       03 窒息性：氮气本身不能致使人窒息，但在一定空间内，如果氮气过多而隔绝氧气，操作者也会引起窒息。

       因而，在操作液氮罐时，需要注意以下安全使用规范：

       01 防止冻伤。虽然它渗透性很弱，但当人体皮肤接触液氮时会受到严重冻伤。在放置细胞时，一定要确保穿戴了厚手套、护目镜、实验服；

       02 操作轻柔，防止液氮溅出；

       03 尽可能地快速操作。由于液氮在空气中会迅速吸热气化，为了避免样品温度变化影响其质量，需尽快操作；

       04 做好维护。定时查看液氮余量，确保罐内液体高度没过重要样品，Z少时，液氮不可少于罐体容积的三分之一。

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永合创信的样本冻存解决方案将使您的样本冻存管理工作变得异常轻松！

目前面临样本冻存中的常见问题

A. 每次打开超低温冰箱取样本，总是要翻找很久！

B．冻存几年之后，翻出一些样本，却不知道是什么，也不知道是谁存的，无法判断是否还可以用。

C. 取出样本再存的时候，发现位置被占用了，换个位置再存后，自己也不记得样本放在哪了。

D. 将一批样本用皮筋和塑料袋包扎找个空位置放进去，感觉到冰箱空间利用率太低。

E. 用了冻存盒没有用冻存架，所以取用Z里面的盒子要“翻腾很久很久”，超低温冰箱开门时间很长。

F. 需要保存血液，组织块，DNA等，混在一起怕搞乱，分开了怕对不上。

G. 给样本做了记号，但是记号笔笔迹模糊辨认不清了。一台冰箱几万个标本，稍不小心就搞错。

H．统计不出冰箱里确切存了多少标本，整理报告让人犯晕。

永合创信样本冻存解决方案

一、永合创信冻存架特点：

1、wan美匹配市场上各品牌的全系列型号超低温冰箱（Haier、Thermo、Sanyo、Effendorf、中科美菱、澳柯玛、中科都菱等所有冰箱品牌）。

2、安全可靠

采用SUS304不锈钢材质，轻便防锈，适于低温保存环境下使用。

3、结构多样

冻存架针对卧式、立式超低温冰箱以及液氮罐等低温设备，可以提供适于不同使用需求的冻存架。采用隔层的方式增加储存物品数量，易于分辨物品种类。

4、可靠的质量做工

完全机械化制作而成，机械化焊接、机械化打磨边角、外观精美，质量可靠，操作方便。

二、永合创信冻存盒

1、全塑料、纸质等不同材质冻存盒，便于长期或短期储存；

2、所有冻存盒盒盖上均有位置识别功能；

3、可高压灭菌并在 -196°C 至 +121°C 温度范围内使用的塑料盒；

4、冻存盒盒底部有隔板和通风孔，便于液体流出和空气流通；

5、提供多种规格，如81孔2英寸、100孔2英寸等。

三、永合创信冻存管

1、冻存管采用医用聚丙烯（PP）为原料，是专用于储存生物样本的一次性实验室耗材；

2、管帽纹路易于旋转盖子；

3、管帽与管身都采用相同批次的型号的PP原料生产，因此相同的膨胀系数确保了任何温度下都能密封；

4、大面积的标记区域方便书写；

5、管体透明度极高，易于观察样本；

6、圆形底部设计便于倾倒液体，减少残留。

四、冻存架参数

（来源：青岛永合创信电子科技有限公司）