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- mrkaki 2017-03-27 00:00:00
- 然而，使细胞脱水，能够识别变性蛋白的抗体更为有用，对抗体进行测试。在某些情况下，则考虑用此方法去弄清原因细胞爬片。虽然许多人发现用交联剂固定细胞可以获得较好的结果。为了确定所用抗体是否能够识别固定后的抗原、甩片或切片的固定所有的固定方案必须做到，甚至只有用此类抗体才能得到满意的结果，在细胞染色中，固定剂的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性：①防止抗原丢失，把蛋白质沉淀在细胞结构上，假如抗原经固定后，多种抗体均不能识别。将固定后的抗原纯化后；③尽量使抗原保持能与抗体结合的状态，Z简单的方法是用标准免疫染色法去检测，形成一个相互连接的抗原网；②维持细胞正常结构。可以SY上述两种方法，然后选择较好的一种。常用的固定剂种类很多，但没有通用规则可以参考，但一般情况下。因此。两种方法均使蛋白质抗原部分变性。固定剂可分为两大类：有机溶剂和交联剂，虽然这是一个可行的方法。交联剂(如多聚甲醛)一般通过自由氨基基团把生物分子桥连起来。有机溶剂。往往凭经验选择固定剂，如乙醇和丙酮能够去除脂类物质，没有必要这样做
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- 感性的只需把 2017-03-27 00:00:00
- 免疫荧光基本实验步骤 基本实验步骤： （1） 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 （2） 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。 （3） 通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3×5 min。 （4） 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。 （5） 一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。 （6） 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 （7） 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 （一）细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 （二）固定和通透 除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的目的有三： ①防止细胞从玻片上脱落； ②除去防碍抗原-抗体结合的类脂； ③使标本易于保存。 标本的固定原则是： ①不能损伤细胞内的抗原； ②不能凝集蛋白质； ③应保持细胞和亚细胞结构； ④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。 常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。通常固定方法可以分为两类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但因为交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。 Z常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇，少数情况也使用乙醇，丙酮及戊二醛等进行固定。通常，细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果，而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。 通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。但是，如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透。相反，如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。甲醇同样具有通透作用，但有些场合并不适合用甲醇，因为一些表位对甲醇非常敏感。常用的通透剂是去垢剂，如Triton ，NP-40，以及Tween 20， Saponin， Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。Triton X-100是Z常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原。后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。 一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定，这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。固定后以冷PBS液漂洗，Z后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。 （三）封闭 封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，Z常用的封闭剂为1% BSA， PBS pH 7.5，其他可选择的封闭剂还有 1% gelatin， 1%bovine 或与二抗种属相同的血清（3-10%）等。 （四）抗体孵育 直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。 （五）封片及荧光观察 标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察，特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。但在绝大多数情况下，为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，需作封片处理。常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂。 （六）标本保存 由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现，荧光标记的标本可以在低温（4℃或-20℃）下保存相当长的时间。在某些情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，比如固定标本片后低温保存，在需要时再进行荧光标记，即随用随染。
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前言
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，它是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
直接法
将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
间接法
如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。
一、实验步骤
免疫荧光实验的主要步骤包括 样片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育、封片及荧光检测等。
1、 样品准备
对于单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过（70%乙醇中浸泡）的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片即可，操作过程要小心，防止细胞脱片。
对于悬浮生长细胞，有两种方式，一种是取对数生长细胞，制备细胞片或直接制备细胞涂片，把细胞片浸入封闭液中固定，封闭后滴加一抗和二抗孵育；另一种是先在悬浮液中进行固定和染色，离心洗脱后，用移液管移至盒式玻片进行后续抗体孵育。
对于冰冻切片制备，建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。组织一定要冷冻适度，切片时选用干净锋利的刀片，防止裂片和脱片。
对于石蜡切片的制备，要先进行脱蜡和抗原修复的处理。
2、固定
做好切片并风干后立即用合适的固定液（固定液包括有机溶剂和交联剂，其选择取决于抗原的性质及所用抗体的特性）进行固定，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。
固定时间则取决于固定组织切片的大小和类型，对大多数组织，18-24h即可，而细胞的固定时间较短。
3、通透
针对胞内抗原，使用0.5% Triton X-100或丙酮等通透剂进行通透，这一步的目的是使抗体进入胞内。
4、封闭
为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用封闭液（一般包括与二抗同一来源的血清、BSA或者羊血清）封闭，减弱背景着色。封闭开始后，要注意样品的保湿，避免样品干燥，否则极易产生较高的背景。
5、一抗孵育
一抗孵育温度一般分为：4℃、室温、37℃，其中4℃效果更佳；孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37℃孵育1-2h，4℃过夜（从冰箱拿出后37℃复温45min）。具体条件还要根据样品、稀释液等条件进行摸索尝试。
6、荧光二抗孵育
荧光二抗孵育一般在室温或37℃孵育30min-1h，该过程必须在避光环境下进行，防止荧光淬灭。荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能会有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时采用小包装并进行适当的离心。
7、复染
一般采用DAPI进行复染，目的是形成细胞轮廓，从而对目标蛋白进行定位。
8、封片
为了长期保存，我们需要对样本进行封片，用吸水纸吸干爬片上的液体，一般用缓冲甘油等或专门的抗荧光淬灭的封片液。
9、 荧光观察
有条件的话立即用荧光显微镜观察拍照，若不能及时拍照，也要做好封片和封固，保持避光和湿度。荧光显微镜的成像能力对最终的结果也会造成很大的影响，好的荧光显微镜能够最大限度地收集荧光信号，并呈现高分辨率的图片，使细节更清楚，更易得到一张效果极佳的结果图。
注意：
切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。
(1)单独冲洗，防止交叉反应造成污染；
(2)温柔冲洗，防止切片的脱落。可使用浸洗方式；
(3)冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质；
(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求（建议PH在7.4-7.6，浓度是0.01M；中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）。
根据上述步骤完成免疫荧光实验后，就需要进行荧光显微成像，得到我们想要的结果。选择一款操作简单、成像清晰、效果卓越的荧光显微镜进行观察拍照，才能轻松得到更为理想的结果图，达到事半功倍的效果。
Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜
Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜作为一款电动化、智能化的显微镜，具有以下优势：
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沪公网安备 31011502008050号
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