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导论
乳糖操纵子（lacO）是一组埃希氏菌属大肠杆菌基因， 负责细菌中的乳糖代谢。乳糖阻遏物对它的调节是分子生物学中一个被充分研究的系统。而乳糖阻遏物这一个DNA 结合蛋白（lacI）是控制乳糖操纵子的关键。 该系统的平衡解离常数（KD）通常估计在 nM 范围内。 

这种 lacO / lacI 系统通常在本科基因调控的生物化学和生物学课程中引入。更高级关于 lacO / lacI 的研究包括成像和染色质编辑中的应用。 

在更广泛的领域里，SPR 对蛋白质-DNA 复合物研究在理解基因表达调节途径中有相当重要的地位。
在这篇应用笔记我们将分享蒙特利尔大学学术实验室如何使用 P4SPR 来确定 lacO / lacI 系统的结合强度（亲和力，KD）。实验室技术人员通过易用的 P4SPR 和相应的用户界面来开发 SPR 测定，以便于在本科实验课程中演示该生物系统。

图1 乳糖操纵子与乳糖阻遏蛋白组合

实验装置

系统设置

图2 台式P4SPR设置

USB 供电的 P4SPR 可以连接到笔记本电脑，通过 P4SPR控制软件启动操作控制和数据记录。易于使用的界面让用户可以轻松设置 P4SPR。 首先，把微流体单元（图3）盖在金传感器芯片上并紧密固定在传感器芯片腔中。然后在样品和参比通道中注入溶液以稳定基线。 S 形样品通道具有 3 个平行的感应区域，其可以提供一式三份的样品测量以及与参考通道的一次控制测量。 通过透明通道可以在直接观察在通道中是否有形成的气 泡，以便立即清除而防止任何信号丢失。

图3 P4SPR微流体单元

实验步骤

在达到基线稳定后，将硫醇化的 LacO DNA 注入样品通道。 固定化自发地造成强金-硫键形成，直到 SPR 表面饱和后产生平台信号。 然后注射互补的 LacO 寡聚体以允许杂交。在结合测定之前彻底洗涤传感器表面。 通过先前储备的液蛋白溶液来制备 5, 20, 50, 100 和200nM 的溶液。 依次注入每种逐渐增加浓度的溶液， 并用其中的大量洗涤溶液和再生缓冲液孵育 10 分钟，以从先前溶液中除去剩余的 LacI 蛋白。记录来自所有4 个通道的数据，然后导出到 Excel 进行进一步的数据分析。
 
结果和讨论
在该实验中，从样品通道得到 3 条平行结合曲线。 对该信号进行平均后从参考信道信号中减去来取得 SPR 信号相对于时间绘制（图 5）。使用不同浓度的结合位移来建立结合等温线，从而确定 KD（图 6）。
计算的 KD 为 6.4±1.2nM，符合相关低浓度基于 LacI 的转录YZ蛋白的文献报道值1。值得注意的是，与已发表论文中使用的 DNA 结合分析相比，SPR 分析不需要任何 DNA 放射性标记，并且可实时监测结合相互作用。

P4SPR 优势
P4SPR 独特的模块式，便携和多通道设计使其成为用于药物发现，生物/传感和系统集成应用的灵活台式 SPR 工具。 它几乎不需要样品制备，使得系统设置快速简单，同时节省了用户在纯化试剂盒和试剂上的成本。此外，P4SPR 利用薄膜 SPR 的高灵敏度和更深的穿透深度来准确测量和结合的亲和力。

总结
P4SPR 成功地展出乳糖操纵子 DNA 与其阻遏蛋白的结合相互作用，并且数据可从之前发表的文献验证。 本科生可从该实验熟悉该 SPR 技术及其在监测生物分子相互作用中的应用。 此外，P4SPR 系统也可考察其他生物系统，如 DNA-DNA，RNA 以及适体对，可以帮助科研人员更好地了解结合并揭示生物通路中的功能。
 
致谢
我们要感谢 Philipe Lampron，Shona Teijeiro 和蒙特利尔生物化学大学的 SébastienTruche 开发该化验。
 
关于 Affinité Instruments
Affinité Instruments 成立于 2015 年，是一个从蒙特利尔大学衍生的企业。Affinité Instruments 的创始人在 SPR 领域积累了十多年丰富的研究结果的知识，并通过多元化的商业，科学和工程领域经验将创新的 SPR 技术商业化。

参考文献
1 Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities of engineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation. doi: https://doi.org/10.1101/477893

导论
乳糖操纵子（lacO）是一组埃希氏菌属大肠杆菌基因， 负责细菌中的乳糖代谢。乳糖阻遏物对它的调节是分子生物学中一个被充分研究的系统。而乳糖阻遏物这一个DNA 结合蛋白（lacI）是控制乳糖操纵子的关键。 该系统的平衡解离常数（KD）通常估计在 nM 范围内。这种 lacO / lacI 系统通常在本科基因调控的生物化学和生物学课程中引入。更高级关于 lacO / lacI 的研究包括成像和染色质编辑中的应用。 

在更广泛的领域里，SPR 对蛋白质-DNA 复合物研究在理解基因表达调节途径中有相当重要的地位。
在这篇应用笔记我们将分享蒙特利尔大学学术实验室如何使用 P4SPR 来确定 lacO / lacI 系统的结合强度（亲和力，KD）。实验室技术人员通过易用的 P4SPR 和相应的用户界面来开发 SPR 测定，以便于在本科实验课程中演示该生物系统。

图1 乳糖操纵子与乳糖阻遏蛋白组合

实验装置

系统设置

图2 台式P4SPR设置

USB 供电的 P4SPR 可以连接到笔记本电脑，通过 P4SPR控制软件启动操作控制和数据记录。易于使用的界面让用户可以轻松设置 P4SPR。 首先，把微流体单元（图3）盖在金传感器芯片上并紧密固定在传感器芯片腔中。然后在样品和参比通道中注入溶液以稳定基线。 S 形样品通道具有 3 个平行的感应区域，其可以提供一式三份的样品测量以及与参考通道的一次控制测量。 通过透明通道可以在直接观察在通道中是否有形成的气 泡，以便立即清除而防止任何信号丢失。

图3 P4SPR微流体单元

实验步骤

在达到基线稳定后，将硫醇化的 LacO DNA 注入样品通道。 固定化自发地造成强金-硫键形成，直到 SPR 表面饱和后产生平台信号。 然后注射互补的 LacO 寡聚体以允许杂交。在结合测定之前彻底洗涤传感器表面。 通过先前储备的液蛋白溶液来制备 5, 20, 50, 100 和200nM 的溶液。 依次注入每种逐渐增加浓度的溶液， 并用其中的大量洗涤溶液和再生缓冲液孵育 10 分钟，以从先前溶液中除去剩余的 LacI 蛋白。记录来自所有4 个通道的数据，然后导出到 Excel 进行进一步的数据分析。
 
结果和讨论
在该实验中，从样品通道得到 3 条平行结合曲线。 对该信号进行平均后从参考信道信号中减去来取得 SPR 信号相对于时间绘制（图 5）。使用不同浓度的结合位移来建立结合等温线，从而确定 KD（图 6）。
计算的 KD 为 6.4±1.2nM，符合相关低浓度基于 LacI 的转录YZ蛋白的文献报道值1。值得注意的是，与已发表论文中使用的 DNA 结合分析相比，SPR 分析不需要任何 DNA 放射性标记，并且可实时监测结合相互作用。

P4SPR 优势
P4SPR 独特的模块式，便携和多通道设计使其成为用于药物发现，生物/传感和系统集成应用的灵活台式 SPR 工具。 它几乎不需要样品制备，使得系统设置快速简单，同时节省了用户在纯化试剂盒和试剂上的成本。此外，P4SPR 利用薄膜 SPR 的高灵敏度和更深的穿透深度来准确测量和结合的亲和力。

总结
P4SPR 成功地展出乳糖操纵子 DNA 与其阻遏蛋白的结合相互作用，并且数据可从之前发表的文献验证。 本科生可从该实验熟悉该 SPR 技术及其在监测生物分子相互作用中的应用。 此外，P4SPR 系统也可考察其他生物系统，如 DNA-DNA，RNA 以及适体对，可以帮助科研人员更好地了解结合并揭示生物通路中的功能。
 
致谢
我们要感谢 Philipe Lampron，Shona Teijeiro 和蒙特利尔生物化学大学的 SébastienTruche 开发该化验。
 

参考文献
1 Tungtur et al. Reconciling in vitro and in vivo activities of engineered, LacI3 based repressor proteins:Contributions of DNA looping and 4 operator sequence variation. doi: https://doi.org/10.1101/477893

含能材料如 1,3,5- 三硝基氢- 1,3,5-三嗪（RDX）（图一）已被广泛用于制造弹药， 并占世界各地现役和前军事设施的污染很大一部分1。大多数RDX 不会在土壤保留，并且只能缓慢生物降解。因此，RDX 可以很容易地渗透到地面，污染周围人群的饮用的地下水。 RDX 不仅被归类为潜在的致癌物质，如果吸入或摄入它也会损害神经系统。因此，对于公共安全来说理想情况下，地下水中的 RDX 水平需要长期监测以减少 RDX 暴露于人群并限制其潜在的不利健康影响。

图一  1,3,5-三硝基氢-1,3,5-三嗪的结构（RDX）

目前专门用于检测环境样品中的高能材料的 EPA 8330b 方案是在实验室中通过集中式的GX液相色谱(HPLC-UV)。 虽然这种方法很灵敏，但由于需要在测试前进行采样，运输，储存和样品制备而造成这种方法非常耗时。采样和测试之间过程需要提前至少 24 小时，几天或几周都不罕见。使用无标记传感方法对 RDX 进行现场测试可将采样时间从数天缩短至数小时，显着降低RDX 暴露于关注区域人群的风险。

表面等离子体共振(SPR)已经被证明在生物传感中有无标记和实时监测优势。开发 SRP 的新应用中尤其是便携式应用所得益处可扩展到对有害污染物的环境监测。

在本应用笔记中，我们将会介绍通过组合创新便携式SPR 和高度特定 RDX 识别所进行的监控井周围地下水里RDX 的现场监测。便携式 SPR 在不同的分析参数包括灵敏度，选择性，检测限和温度的影响证明了潜在适用性， 也相对比实验室中集中式的 HPLC-UV 方法达到更快的测试。

实验设置
P4SPR 设备设置

图二  P4SPR设置示意图（上）实际皮卡车后部现场设置（下）

部署 P4SPR 仪器在抽样现场被选择在加拿大冬季和夏季(-20ᵒC 至 30ᵒC 的温差)。为避免雨雪所造成的损害，设备临时被设置在桌子或垫子上（图二）。  该设备由笔记本电脑通过 USB 供电而发电机供应笔记本的备份电池。蠕动泵分两个阶段来抽取井水样品以控制装置处的流动。首先井水样被泵入大型收集桶中。   然后，收集桶的水再泵入 P4SPR。 在 P4SPR 中，微流体单元的前 3 通道导入水样到 RDX 选择性的 SPR 传感器上。未污染的水样被导入第四通道中，用于参考信号来校正温度变化（图  三）。 因此，每个样品一式三份进行测量并实时校正。

图三  四通道微流体通道单元和通道示意图

实验步骤
传感器芯片可通过二苯胺聚合物与 Au 纳米颗粒交联功能化，具有 RDX 选择性的分子印迹聚合物(MIP)(图四)。
SPR 传感器在实验室中用 RDX 的水溶液已先前进行验证。同时温度对 SPR 灵敏度的影响也在实验室中从 2℃至 36℃ 测量环境相关范围得到 1nM 至 50nM 的校准曲线。在现场分析时，校准曲线是从上游未污染的水来制备的。

图四  在ITO载玻片上没有MIP（左）MIP的暗视野图像，橙色点是金纳米粒子（右）2

从井中的收集污染样品会根据净化水参考信号分析。此外，每个传感器的响应都会经过 10nM RDX 标准响应来归一化。


结果和讨论
实验室中的分析验证

在现场测试之前，SPR 方法首先在实验室进行了验证， 经过 1pM 至 10nM 的 RDX 溶液以 1mL / min 的速度在传感器上连续流动来测量 SPR 传感器的灵敏度(图五，上)。

由于实地考察将面临极端的季节宽温度范围，实验室条 件仿真是用来开发该方法来考虑和校正温度对SPR 响应的影响。 从 SPR 传感器灵敏度可观察到主要温度效应。但是，对于，使用 10 nM 的 SPR 信号对校准曲线进行每条曲线的归一化可在相关温度范围内为高于 0.1 nM 浓度提供更一致的灵敏度(图六)。 随后的现场测试中应用了该归一化方法。

图五  用于RDX检测的传感器校准的SPR传感图（上）SPR响应相对于10nM标准进行标准化。误差棒代表三次重复测量的标准偏差（n=3）（下）。

图六  RDX在不同温度下，归一化的校准曲线对10nM的SPR响应

RDX 的现场 SPR 测试
当前的SPR 现场测试方法几乎无任何基础设施要求。帐篷，拖车或 SUV 的后挡板等临时避难所已足够证明在采样点部署 P4SPR 的可行性(图 7)。 每个井口从到达现场到完成 SPR 分析只需Z多 90 分钟。 这包括采样系统和 P4SPR 的设置，蒸馏水和未污染水的平衡，样品的测量以及重新校准。 与 EPA HPLC-UV 标准测试方法相比，SPR 现场测试节省了样品运输和制备的时间。 现场SPR 方法明显更快，特别是在偏远地区更适合频繁监测环境样品。

图七  部署P4SPR在不同季节的照片

此外，用现场 SPR 方法产生的数据显示出与 HPLC EPA方法 8330b 的良好相关性。 这证明了现场 SPR 方法的巨大潜力不仅可以作为集中测试的现场筛选工具，甚至可以替代它。

表一 SPR方法和EPA方法8330b的比较报告，不同的井做现场采样。报告的浓度以ppb为单位。2ppb对应于约10nM

P4SPR 优势
Affinité Instruments 仪器的 P4SPR 重量轻，集成度高， 便于携带，适合在各种环境条件下进行现场测试。 对现场设置空间和信号稳定性的Z低要求大大减少了相对传统方法(如 HPLC-UV)的采样时间。不同的表面化学物可通过调节SPR 传感器的选择性质来取得感兴趣的分析物。 此外，SPR 传感器能够直接检测无需样品制备，可称为一个通用的传感器。

结论

该应用报告证明 P4SPR 为采样井现场分析 RDX 提供了zhuo越的分析性能。 由于和标准 HPLC 方法以及实验室样品的 P4SPR 分析具有良好的相关性，用户可以放心地将 P4SPR 用于现场快速测试偏远地区的含能材料。 该仪器的便携性和坚固性已经证明它是环境监测出色的选择，具有大大扩展其他污染物应用的潜力。

公司简介

Affinité Instruments 成立于 2015 年，是一个从蒙特利尔大学衍生的企业。Affinité Instruments 的创始人在 SPR 领域积累了十多年丰富的研究结果的知识，并通过多元化的商业，科学和工程领域经验将创新的 SPR 技术商业化。

参考文献

1 M. Mailloux, R. Martel, U. Gabriel, R. Lefebvre, S. Thiboutot and G. Ampleman, J. Environ. Qual., 2008, 37, 1468.

2 M. Riskin, R. Tel-Vered and I. Willner, Adv. Mater., 2010, 22, 1387–1391.

2020 药典

2020年版《ZG药典》共收载品种5911种，其中，新增319种，修订3177种，不再收载10种，因品种合并减少6种。

一部中药收载2711种，其中新增117种、修订452种。

二部化学药收载2712种，其中新增117种、修订2387种。

三部生物制品收载153种，其中新增20种、修订126种；新增生物制品通则2个、总论4个。

四部收载通用技术要求361个，其中制剂通则38个（修订35个）、检测方法及其他通则281个（新增35个、修订51个）、指导原则42个（新增12个、修订12个）；YY辅料收载335种，其中新增65种、修订212种。

迪马色谱柱

2020年版《ZG药典》中，共有16个药物品种推荐使用迪马色谱柱，其中无水乳糖和乳糖的检测详见下方。

● 无水乳糖

   2020《ZG药典》第四部第613页

● 色谱柱货号及规格：

   Cat#: 99301

   Dikma Polyamino HILIC 

   250x4.6mm,5μm

● 检测项目：

   含量测定：色谱条件与系统适用性试验

● 乳糖

   2020《ZG药典》第四部第691页

● 色谱柱货号及规格：

   Cat#: 99301

   Dikma Polyamino HILIC

   250x4.6mm,5μm

● 检测项目：

   含量测定：色谱条件及系统适用性试验

乳糖的检测

2020药典及公示稿原文

无水乳糖、乳糖2020药典公示稿截图：

无水乳糖、乳糖2020药典截图

氨基键合聚合物色谱柱

1. 样品制备

蔗糖、乳糖的混标，浓度5mg/mL，溶剂水。

2. 分析条件

色谱柱：Dikma Polyamino HILIC 5μm Cat.No：99301

流动相：70%乙腈水

流速：1.0mL/min

柱温：30℃

检测器：RI 30℃

进样量：10μL

3. 色谱图

1. 用屈臣氏的水配流动相

2.用净水机的水配流动相

3.色谱柱柱温调为40℃，流动相是屈臣氏的水

氨基键合硅胶色谱柱

1. 样品制备

蔗糖、乳糖的混标，浓度5mg/mL，溶剂水。

2. 分析条件

色谱柱：Inspire 5μm NH2, 250x4.6mm Cat.No：81706

流动相：70%乙腈水

流速：1.0mL/min

柱温：30℃

检测器：RI 30℃

进样量：10μL

3. 色谱图

含能材料如 1,3,5- 三硝基氢- 1,3,5-三嗪（RDX）（图一）已被广泛用于制造弹药， 并占世界各地现役和前军事设施的污染很大一部分1。大多数RDX 不会在土壤保留，并且只能缓慢生物降解。因此，RDX 可以很容易地渗透到地面，污染周围人群的饮用的地下水。 RDX 不仅被归类为潜在的致癌物质，如果吸入或摄入它也会损害神经系统。因此，对于公共安全来说理想情况下，地下水中的 RDX 水平需要长期监测以减少 RDX 暴露于人群并限制其潜在的不利健康影响。

图一  1,3,5-三硝基氢-1,3,5-三嗪的结构（RDX）

目前专门用于检测环境样品中的高能材料的 EPA 8330b 方案是在实验室中通过集中式的GX液相色谱(HPLC-UV)。 虽然这种方法很灵敏，但由于需要在测试前进行采样，运输，储存和样品制备而造成这种方法非常耗时。采样和测试之间过程需要提前至少 24 小时，几天或几周都不罕见。使用无标记传感方法对 RDX 进行现场测试可将采样时间从数天缩短至数小时，显着降低RDX 暴露于关注区域人群的风险。

表面等离子体共振(SPR)已经被证明在生物传感中有无标记和实时监测优势。开发 SRP 的新应用尤其是便携式应用所得益处可扩展到对有害污染物的环境监测。

在本应用笔记中，我们将会介绍通过组合创新便携式SPR 和高度特定 RDX 识别所进行的监控井周围地下水里RDX 的现场监测。便携式 SPR 在不同的分析参数包括灵敏度，选择性，检测限和温度的影响证明了潜在适用性， 也相对比实验室中集中式的 HPLC-UV 方法达到更快的测试。

实验设置
P4SPR 设备设置

图二  P4SPR设置示意图（上）实际皮卡车后部现场设置（下）

部署 P4SPR 仪器在抽样现场被选择在加拿大冬季和夏季(-20ᵒC 至 30ᵒC 的温差)。为避免雨雪所造成的损害，设备临时被设置在桌子或垫子上（图二）。  该设备由笔记本电脑通过 USB 供电而发电机供应笔记本的备份电池。蠕动泵分两个阶段来抽取井水样品以控制装置处的流动。首先井水样被泵入大型收集桶中。   然后，收集桶的水再泵入 P4SPR。 在 P4SPR 中，微流体单元的前 3 通道导入水样到 RDX 选择性的 SPR 传感器上。未污染的水样被导入第四通道中，用于参考信号来校正温度变化（图  三）。 因此，每个样品一式三份进行测量并实时校正。

图三  四通道微流体通道单元和通道示意图

实验步骤
传感器芯片可通过二苯胺聚合物与 Au 纳米颗粒交联功能化，具有 RDX 选择性的分子印迹聚合物(MIP)(图四)。SPR 传感器在实验室中用 RDX 的水溶液已先前进行验证。同时温度对 SPR 灵敏度的影响也在实验室中从 2℃至 36℃ 测量环境相关范围得到 1nM 至 50nM 的校准曲线。在现场分析时，校准曲线是从上游未污染的水来制备的。

图四  在ITO载玻片上没有MIP（左）MIP的暗视野图像，橙色点是金纳米粒子（右）2

从井中的收集污染样品会根据净化水参考信号分析。此外，每个传感器的响应都会经过 10nM RDX 标准响应来归一化。

结果和讨论
实验室中的分析验证

在现场测试之前，SPR 方法首先在实验室进行了验证， 经过 1pM 至 10nM 的 RDX 溶液以 1mL / min 的速度在传感器上连续流动来测量 SPR 传感器的灵敏度(图五，上)。

由于实地考察将面临极端的季节宽温度范围，实验室条件仿真是用来开发该方法来考虑和校正温度对SPR 响应的影响。 从 SPR 传感器灵敏度可观察到主要温度效应。但是，对于，使用 10 nM 的 SPR 信号对校准曲线进行每条曲线的归一化可在相关温度范围内为高于 0.1 nM 浓度提供更一致的灵敏度(图六)。 随后的现场测试中应用了该归一化方法。

图五  用于RDX检测的传感器校准的SPR传感图（上）SPR响应相对于10nM标准进行标准化。误差棒代表三次重复测量的标准偏差（n=3）（下）。

图六  RDX在不同温度下，归一化的校准曲线对10nM的SPR响应

RDX 的现场 SPR 测试
当前的SPR 现场测试方法几乎无任何基础设施要求。帐篷，拖车或 SUV 的后挡板等临时避难所已足够证明在采样点部署 P4SPR 的可行性(图 7)。 每个井口从到达现场到完成 SPR 分析低于 90 分钟。 这包括采样系统和 P4SPR 的设置，蒸馏水和未污染水的平衡，样品的测量以及重新校准。 与 EPA HPLC-UV 标准测试方法相比，SPR 现场测试节省了样品运输和制备的时间。 现场SPR 方法明显更快，特别是在偏远地区更适合频繁监测环境样品。

图七  部署P4SPR在不同季节的照片

此外，用现场 SPR 方法产生的数据显示出与 HPLC EPA方法 8330b 的良好相关性。 这证明了现场 SPR 方法的巨大潜力不仅可以作为集中测试的现场筛选工具，甚至可以替代它。

表一 SPR方法和EPA方法8330b的比较报告，不同的井做现场采样。报告的浓度以ppb为单位。2ppb对应于约10nM

P4SPR 优势
Affinité Instruments 仪器的 P4SPR 重量轻，集成度高， 便于携带，适合在各种环境条件下进行现场测试。 对现场设置空间和信号稳定性的要求大大减少了相对传统方法(如 HPLC-UV)的采样时间。不同的表面化学物可通过调节SPR 传感器的选择性质来取得感兴趣的分析物。 此外，SPR 传感器能够直接检测无需样品制备，可称为一个通用的传感器。

结论

该应用报告证明 P4SPR 为采样井现场分析 RDX 提供了优异的分析性能。 由于和标准 HPLC 方法以及实验室样品的 P4SPR 分析具有良好的相关性，用户可以放心地将 P4SPR 用于现场快速测试偏远地区的含能材料。 该仪器的便携性和坚固性已经证明它是环境监测出色的选择，具有大大扩展其他污染物应用的潜力。

参考文献

1 M. Mailloux, R. Martel, U. Gabriel, R. Lefebvre, S. Thiboutot and G. Ampleman, J. Environ. Qual., 2008, 37, 1468.

2 M. Riskin, R. Tel-Vered and I. Willner, Adv. Mater., 2010, 22, 1387–1391.

       香甜顺滑的牛奶是不是人人都爱！额，但有人想说爱你不容易！因为乳糖不耐受。研究显示全世界范围内亚洲人的乳糖不耐受人群比例Z高，达到90%以上。每个人的症状表现也不一样，可能是腹痛，也可能是腹胀、腹泻等。但是乳制品是人类重要的营养来源，怎样才能既享用美味的牛奶又减少症状发生呢？食品供应商发明了低乳糖牛奶，这样大家都可以开森地喝牛奶啦。

       说到这里，安东帕旋光仪可以帮助食品供应商准确地检测牛奶中的乳糖含量！

检测方法

原理

       旋光仪测定乳糖的含量是基于乳糖的光学活性。旋光度取决于光程长l及乳糖的含量：

       刚溶解的乳糖会在α-水合乳糖与β–乳糖间转化，因此测量前需要等待达到平衡，可加入几滴10%的氨水溶液加快转化以达到平衡，平衡后的比旋度为52.6°，然而无水α-水合乳糖和β–乳糖的比旋光度为55.4°。

旋光测定法是一种光学方法，一束偏振光穿过样品，故在测量之前，牛奶中的脂肪及蛋白质需要被沉淀析出/ 澄清。

       存在几种不同的沉淀析出方法，例如，Carrez澄清，醋酸铅澄清，AOAC参考方法896.01等。

       所有这些方法都基于3个基本操作：牛奶与试剂混合，澄清，过滤，测量旋光度，通过旋光度计算出乳糖含量。

MCP5100/5300/5500 旋光仪带帕尔贴半导体控温组件。

某品牌样品经混合、澄清、过滤后测量结果（t0为混合时间，min）：

脂质体是由同心磷脂双分子层组成的磷脂囊泡，这些双分子层包围起来形成一个水性空间[1]（图1所示）。磷脂尾由两条疏水的长脂肪酸链组成，它们聚集在一起以ZD限度地减少与水分子的相互作用，即疏水作用。脂质体在药物递送领域具有重要的意义，因为其无毒、生物相容性和可生物降解。最重要的是，它们可以通过将药物插入双层的疏水部分或脂质体的水性内部来递送药物[2]。此外，脂质体可以保护药物不被酶降解和被肾脏过滤掉[2]。

图1 脂质体的结构和修饰以将药物输送到特定细胞

为了将脂质体输送到特定类型的细胞，脂质体需要用抗体、配体[2]或其他蛋白质或肽进行修饰，如图1所示。一旦修饰的脂质体被靶细胞上的特定受体识别，它们就会在称为受体介导的内吞作用的过程中被细胞吸收（图2），从而将药物分子输送到细胞质中[3, 4]。例如，叶酸（一种配体）及其结合受体叶酸结合蛋白（FBP）通常用于研究癌症研究中的药物递送策略，因为FBP在多种人类癌症中过度表达，例如卵巢癌、脑癌、肾和肺[3, 4]。

图2 配体修饰脂质体的受体介导的内吞作用。DY个脂质体被放大以清楚地显示配体。在典型的细胞膜上可以看到配体的受体。配体与受体结合后，细胞膜在脂质体周围闭合形成囊泡，将携带药物的脂质体捕获在其中，然后在细胞内进一步加工以将药物释放到细胞质中。

聚乙二醇（PEG）是众所周知的一种物质，通常用于防止蛋白质的表面吸附[5]。对于脂质体的应用，通常添加PEG以延长脂质体在人体内的循环时间，因为没有它，未修饰的脂质体将在几小时内被参与免疫反应的吞噬细胞清楚[2, 3]。这是因为PEG的存在阻止了吞噬细胞的非特异性吸附，例如[3]。然而，用PEG修饰脂质体的缺点是由于空间位阻，它可能会降低脂质体上的配体与其特异性受体结合的能力。因此，必须在延长脂质体循环时间和ZD化脂质体向靶细胞的递送效率之间进行折衷[2]。

脂质体已固定在表面等离子共振（SPR）传感表面上以研究药物和脂质体的相互作用[6]，并作为一种放大策略来降低干扰素和细菌毒素的检测限，例如[7]。以下实验的目的是证明向叶酸修饰脂质体中添加PEG2000会导致与固定在Affinite P4SPR的SPR金传感表面上的FBP的结合降低（图3）。SPR是一种强大的工具，可以实时、无标记地表征修饰的脂质体。此外，实验室内使用P4SPR仪器可以让研究人员即时执行实验优化，而不是多次使用公共测试ZX的设备进行反复测量，这节省了大量的宝贵时间。

图3 使用Affinite的P4SPR检测聚乙二醇化和非聚乙二醇化叶酸修饰脂质体的方案

实验步骤

使用P4SPR在静态条件下测量SPR。为了固定叶酸受体，通过在MilliQ水中注射500 μL的EDC:NHS 20:5mM来激活16-MHA涂层的金棱镜，并反应20分钟。通过注入1mL 100mM磷酸盐缓冲液彻底清洗表面。然后，在由100mM磷酸盐缓冲液（pH=5）、4mM巯基乙醇和10% v/v 甘油组成的缓冲液中注入300 μL 40nM叶酸结合蛋白（FBP）并反应1小时。FBP固定后，表面用1mL 100mM磷酸盐缓冲液冲洗，以评估生物传感器表面吸附的FBP。注入1mL 1M乙醇胺并反应5min以灭活未反应的NHS基团。传感器用1mL 1×PBS（pH=7.4）冲洗，并注入500μL脂质体样品。所有脂质体悬浮液的浓度为10μM，并固定10min。注入的样品列于表1中，区别仅在于在第二个样品中添加了DOPE-PEG 2000-NH2。在脂质体固定期间，依次用 1 mL 1 x PBS (pH=7.4) 和 1 mL 10 mM 甘氨酸 (pH=1.5) 冲洗表面 5min，ZH用 1 x PBS (pH=7.4)冲洗。

表1

结果

图4显示了一组初步检测结果，其中显示了每个样品的传感图（sensorgrams）。首先，数据显示P4SPR能够通过叶酸和FBP结合亲和力检测脂质体，如从~60s到~750s（绿色）和~60s和~800s（黑色）的两条关联曲线所示）。此外，可以看到，与未聚乙二醇化的叶酸修饰脂质体样品（~110RU，黑色）相比，聚乙二醇化叶酸修饰的脂质体样品（绿色）的共振单位相对变化（~40RU）较低。这表明脂质体表面PEG的存在因为空间位阻而YZ了叶酸修饰脂质体与FBP修饰传感器表面的一些结合，即PEG阻止脂质体上的叶酸与固定在传感器表面上的FBP的结合。

图4 显示了每个脂质体样品获得共振单位的部分传感图

从传感器表面的表面活化和叶酸修饰到脂质体样品的ZZ注射，该实验大约需要3小时才能完成。总SPR运行时间可能更短，因为在初始进样和ZZ进样之间进行了一些样品浓度优化。研究人员可以随时更改实验条件这一事实是在实验室内拥有P4SPR仪器的优势。ZH，即使观察到注射尖峰并且可以优化表面化学和脂质体浓度等其他条件，您可以随时在P4SPR上重复和进一步开发实验。

结论

Affinite P4SPR能够检测叶酸修饰的脂质体，更重要的是，由于PEG引起的空间位阻，可以区分PEG和未聚乙二醇化的叶酸修饰脂质体之间的差异，从而降低叶酸对FBP的亲和力。Affinite P4SPR仪器可用作研究人员的标准检测平台，在进行生物测定或动物实验的进一步测试之前，以快速简单的方式表征脂质体以获得药代动力学特征[8]，从而避免浪费宝贵的研究时间、资源和动物。最重要的是，因为不需要使用公共测试ZX的SPR仪器，P4SPR仪器触手可及的加速了脂质体的研究开发，

致谢

我们感谢 Félix Lussier 博士提供传感图数据。 Félix Lussier 博士来自Max Planck Institute医学研究所细胞生物物理学系。

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参考文献

[1] Parveen Kumar, Peipei Huo, and Bo Liu, “Formulation Strategies for Folate-Targeted Liposomes and Their Biomedical Applications”, Pharmaceutics, 11, 381 (2019).

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