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流式细胞仪如何设置凋亡阳性对照

随风飘飘絮 2016-04-16 16:11:02 920  浏览
  • 本人现在要做流式细胞,做的内容是TNF-α诱导细胞凋亡,用的方法是Annexin V+PI,请问如何设置阳性对照和阴性对照? 新手,请说的越详细越好,或有相关资料发给我也行! 谢谢!cxxxf@qq.com

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全部评论(2条)

  • py平民 2016-12-01 23:17:23
    你的阴性对照就是无任何染色的细胞。 PI阳性对照,可以固定过的死细胞,可以保证都是PI阳性 Annexin阳性的细胞,用trypsin消化时间长一点(比如消化10分钟),大部分也是阳性的。这个也从一个侧面反映出该方法(Annexin V+PI)的非特异性很高。 上机先用阴性对照设置PMT的电压和gate。再用PI和Annexin单染的阳性细胞调节compensation。然后就可以检测双染的样本了。

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  • 叶叶悠然 2016-04-16 23:13:18
    1、必须活细胞检测,不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜. 2、特殊细胞的染色方法:在消化或吹打时,有些细胞(如神经元细胞)很容易受到损伤,导致晚期凋亡或坏死比例非常高,不能反映真实结果.实验的解决方法:先低速离心,吸取细胞培养板中的液体,留少许液体,加入适量PI和Annexin-V染色10min后,将漂浮细胞吸至离心管中,离心洗涤两次,用PBS漂洗贴壁细胞两次,加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中,离心洗涤,再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测.应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例,增加早期凋亡细胞比例. 3、由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白,只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大,因而在消化细胞时,建议一般不采用含EDTA的消化液. 4、必须设置阴性对照和补偿对照(分别单染).

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流式细胞仪如何设置凋亡阳性对照
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