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放疗是头颈部肿瘤的标准治 疗方法，能显著提高患者的长期生存率，但在有头颈部肿瘤病史的患者中，接受过放疗的患者中发生颈动脉狭窄(CAS)的比例为70%，而未接受放疗的患者中发生CAS的比例不到4%。明确放射治 疗CAS的病因和病理作用对CAS的诊断和治 疗有重要意义。

实验方法

近期首都医科大学宣武医院神经外科即中国国际神经科学研究所发表在《Radiotherapy and Oncology》期刊的研究中采用脂质组学策略来比较辐射诱导颈动脉斑块(RICPs)和颈动脉粥样硬化斑块(ASCPs)之间的代谢差异，并使用DESI-MSI来表征脂质的空间分布。相较此前已有的利用MALDI和SIMS方法，获得了更加清晰的生物标志物空间分布，为全面阐明辐射致血管损伤的机制，并确定预防辐射致血管损伤的措施提供了有力支撑。

实验样品

放疗诱导的颈动脉斑块组(RICPs )8例和动脉粥样硬化型颈动脉斑块组(ASCPs)12例。手术切除后，2个RICPs和2个ASCPs样品在冷冻切片机上获得切片，储存在-80℃下进行DESI-MSI和免疫染色。这些样品的剩余组织，以及6个RICPs样品和10个ASCPs样品经均质离心后进行UPLC-QTOF-MS代谢组学分析（图1）。

实验条件

01 UPLC-QTOF-MS:

质谱分析采用Waters UPLC-Xevo G2-XS QTof超高效液相色谱系统结合四极杆飞行时间质谱进行。色谱柱为ACQUITY UPLC CSH C18(2.1 mm*100 mm, 1.7 μm)，采用正离子和负离子两种模式进行数据采集。

02 DESI-MSI:

质谱数据采集采用Waters SYNAPT G2-Si HDMS Q-TOF，以95%甲醇-5%水作为DESI喷雾溶剂，流速2 μL/min，采集质量范围m/z 50-1200，毛细管电压4.5 kV；源温150℃；雾化气氮气压力为0.45 MPa，空间分辨率80 μm。数据处理软件为高清成像软件HDI(High Definition Imaging)。

03免疫染色：

将DESI-MSI成像分析后切片用油红O染色, 相邻切片进行Masson三色染色。

图1. UPLC-QTOF-MS和 DESI-MSI实验流程示意图

实验结果

采用UPLC-QTOF-MS结合OPLS-DA模型比较RICPs和ASCPs的代谢谱。在正离子和负离子模式下基于VIP>1, P<0.05, FC>1.2, 确定了31种在RICPs中显著上调的代谢物（图2）

图2. 辐射诱导颈动脉斑块(RICPs)和颈动脉粥样硬化斑块(ASCPs)样本在正离子(A-C)和负离子(D - F)模式下的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)得分图、S-plot图和火山图。

在31种代谢物中，6种甘油三酯[TG(17:2/17:2/18:0)，TG(17:1/17:2/18:0)、TG(17:0/17:2/18:0)、TG(17:2/17:2/20:0)、TG(17:1/17:2/20:0)、 TG(15:0/22:0/22:2)]在区分两种斑块方面表现良好，DESI - MSI显示胆固醇油酸酯[CE(18:1)]和胆固醇亚油酸酯[CE(18:2)]均匀分布在高丰度的斑块中（图3C），6个TG位于胶原纤维区域（图3D），RICPs胶原纤维区6种TGs的离子强度高于ASCPs，这与UPLC QTOF-MS的结果一致（图4）。

这些结果为区分RICP和ASCP提供了潜在的生物标志物。此外，利用代谢通路分析发现脂质代谢异常、免疫和炎症反应可能参与了RICPs的发生机制。辐射后血管中脂质的消化、吸收、合成和分解均出现异常。研究中观察到的 RICPs中TGs的代谢异常可能与血管衰老和慢性炎症有关。

图3 . (A)解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)扫描后，用油红O染色结果;(B)相邻切片用Masson三色染色结果;(C) DESI-MSI测定的胆固醇油酸酯[CE(18:1)]和胆固醇亚油酸[CE(18:2)]在RICPs和ASCPs中的分布;(D) DESI-MSI确定的RICPs和ASCPs中TGs分布。

图4. UPLC-QTOF-MS 方法得到的6种关键诊断标记物甘油三酯离子强度的Violin图，RICPs：辐射诱导颈动脉斑块，ASCPs:颈动脉粥样硬化斑块。

小结

代谢组学技术是一种发现生物标志物的有力方法，但无法获得代谢产物的空间分布信息。质谱成像(MSI)技术可以将代谢产物原位映射到组织，利用UPLC-QTOF-MS和DESI-MSI将传统代谢组学与空间组学相结合，同时DESI-MSI相对无损的检测方式使得质谱成像分析后的样本可继续进行后续H&E染色及免疫组化等分析，获得同一样本的多维度分析结果，为研究疾病的发生 发展及预防工作提供了新的可靠的科研利器。

随着我国人民的生活水平逐渐提高，动脉粥样硬化在中老年疾病中变得越来越常见。其对应于体内的具体表现，是在动脉壁上堆积脂质和坏死组织，形成斑块（plaque）。目前，有多种成像技术应用在动脉粥样硬化斑块的发现上，如正电子发射断层扫描（Positron Emission Tomography，PET）、核磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）等。但此类单纯的解剖学成像只能判断有无 斑块，却无法评估每一处的风险——动脉粥样硬化始发于儿童时期且持续进展，因而大部分成年人或多或少有些损伤，却并不是每一处都会造成诸如中风等严重后果。因此我们仍需开发新的诊断方法，用于评估每一处斑块存在的风险。其中一个方法，就是检测斑块附近的单核细胞（Monocyte）。

循环单核细胞（Circulating 

Monocyte）主要分为Ly-6Chi与Ly-6Clo两类。研究发现只有Ly-6Chi及其分化的泡沫巨噬细胞与动脉粥样硬化炎症反应相关，并将导致动脉粥样硬化斑块。因此我们寻找的方法，需能够检测Ly-6Chi和巨噬细胞的分布情况。 

在此之前，已经有诸多对巨噬细胞成像的方法。但这些方法对Ly-6Chi单核细胞及其分化的泡沫巨噬细胞均没有很好的选择性。甚至会因为对其他种类细胞的成像而降低诊断准确性。因此在该文章中，作者开发了一种新的单壁碳纳米管（Single-walled Carbon Nanotubes，SWNTs）。实验首先对小鼠进行为期4周的高脂肪饮食，以提供造模前提；而后多次注射链脲霉素——一种糖尿病造模试剂，可使鼠类的血糖升高；之后，于实验第6周对小鼠颈动脉进行结扎，以形成动脉粥样硬化斑块；在第8周注射单壁碳纳米管，并于注射后第6、24、48、72小时对处死小鼠的颈动脉进行光声成像与流式细胞分析。

图1 实验步骤

在流式细胞分析的结果（图2、3）中，可以很清楚地看出很大比例的单壁碳纳米管可高选择性地被Ly-6Chi单核细胞及泡沫巨噬细胞摄取。

图2 流式细胞分析结果1：泡沫巨噬细胞（上二图）和Ly-6Chi单核细胞（下二图）分别摄取了73%和57%的单壁碳纳米管

图3 流式细胞分析结果2：其他免疫细胞摄取了单壁碳纳米管的比例均非常低

光声成像结果也同样表明，在注射单壁碳纳米管6h后，存在动脉粥样硬化斑块的动脉信号强度远高于正常动脉（图4、5）。之后的差距逐渐减小，主要是单壁碳纳米管被代谢所致。

图4 光声信号结果对比

图5 实验组（C）与对照组（D）的成像对比（图C有红白色信号，为强烈的光声信号；图D仅有黑白信号，为超声信号，无光声信号）

文章的这一发现，无疑可以为之后的动脉粥样硬化斑块检测提供思路。正如作者在文章中所言：“对那些促进斑块不稳定和致病的细胞进行成像，可以辨识炎症、高风险血管区域；预测和评估板块脱落风险；指导治疗方向。”

参考文献：

[1] Gifani M, Eddins D J, Kosuge H, et al. Ultraselective Carbon Nanotubes for Photoacoustic Imaging of Inflamed Atherosclerotic Plaques[J]. Advanced Functional Materials, 2021, 2101005

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往期回顾：

● 美国PhotoSound小动物全身3D光声/荧光成像系统

● 小鼠解剖应用笔记 —— 美国PhotoSound小动物全身3D光声/荧光成像系统

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