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  迷雾中等你 2017-04-15 00:00:00

  怎样用NanoDrop 1000测量核酸浓度 电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂： 1、溴化乙锭（ethidium bromide，EB） Z常用的核酸荧光染料，可嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光.EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型.若EB背景太深，可将凝胶 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这 样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低. 在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况.但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了 核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色.EB见光 易分解，应于4℃避光保存， 2、吖啶橙（acridine orange，AO）： 吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发 下产生640nm的红色荧光.因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg和0.05μg.但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时. 3、银（Ag+）试剂： Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒.AgNO3等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色.银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确.银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA 片段回收的制备. 4、亚甲蓝（methylene blue） 可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长.胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5~8h（反复换水），带型肉眼可见，Z低检测量为 250ng.

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