怎样用signal scan分析转录因子结合位点

woekn40366 2017-03-30 01:32:55 235 浏览

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樱风旋律 2017-03-31 00:00:00

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子.植物中的转录因子分为二种，一种是非特异性转录因子，它们非选择性地调控基因的转录表达，如大麦 (Hordeum vulgare) 中的HvCBF2 (C-repeat/DRE binding factor 2) (Xue et al.， 2003).还有一种称为特异型转录因子，它们能够选择性调控某种或某些基因的转录表达.典型的转录因子含有DNA结合区 (DNA-binding domain)、转录调控区 (activation domain)、寡聚化位点(oligomerization site) 以及核定位信号 (nuclear localization signal) 等功能区域.这些功能区域决定转录因子的功能和特性 (Liu et al.， 1999).DNA结合区带共性的结构主要有：1）HTH 和 HLH 结构：由两段α-螺旋夹一段β-折叠构成，α-螺旋与β-折叠之间通过β-转角或成环连接，即螺旋-转角-螺旋结构和螺旋-环-螺旋结构.2）锌指结构：多见于 TFIII A 和类固醇激素受体中，由一段富含半胱氨酸的多肽链构成.每四个半光氨酸残基或组氨酸残基螯合一分子 Zn2+ ，其余约 12-13 个残基则呈指样突出，刚好能嵌入 DNA 双螺旋的大沟中而与之相结合.3）亮氨酸拉链结构：多见于真核生物 DNA 结合蛋白的 C 端，与癌基因表达调控有关.由两段α - 螺旋平行排列构成，其α - 螺旋中存在每隔 7 个残基规律性排列的亮氨酸残基，亮氨酸侧链交替排列而呈拉链状，两条肽链呈钳状与 DNA 相结合. 同一家族的转录因子之间的区别主要在转录调控区.转录调控区包括转录激活区 (transcription activation domain) 和转录YZ区 (transcription repression domain) 二种.近年来，转录的激活区被深入研究.它们一般包含DNA结合区之外的30-100个氨基酸残基，有时一个转录因子包含不止一个转录激活区.如控制植物储藏蛋白基因表达的VP1和PvALF转录因子，它们的N-末端酸性氨基酸保守序列都具有转录激活能力，与酵母转录因子GCN4和病毒转录因子的VP16的酸性氨基酸转录激活区有较高同源性 (Bobb et al.， 1996).典型的植物转录因子激活区一般富含酸性氨基酸、脯氨酸或谷氨酰胺等，如GBF (G-box binding factor) 含有的GCB盒 (GBF conserved box) 激活结构域 (lunwen114 and Bevan， 1998). 转录YZ区也是转录因子调控表达的重要位点，但是对其作用机理研究尚不深入.可能的作用方式有三种：1）与启动子的调控位点结合，阻止其它转录因子的结合；2）作用于其它转录因子，YZ其它因子的作用；3）通过改变DNA的高级结构阻止转录的发生. 转录因子必须在核内作用，才能起到调控表达的目的.因此，转录因子上的核定位序列是其重要的组成部分.一般一个或多个核定位序列在转录因子中不规则分布，同时也存在不含核定位序列的转录因子，它们通过结合到其它转录因子上进入细胞核.核定位序列一般是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的区段.目前，水稻中的GT-2、西红柿中的HSFA1-2、玉米的O2和碗豆的PS-IAA4和6等转录因子中的核定位序列都已被鉴定 (Boulikas， 1994; Dehesh et al.， 1995; Lyck et al.， 1997; Varagona et al.， 1992; Abel and Theologis， 1995). 绝大多数转录因子结合 DNA前需通过蛋白质-蛋白质相互作用形成二聚体或多聚体.所谓二聚体化就是指两分子单体通过一定的结构域结合成二聚体，它是转录因子结合DNA时Z常见的形式.由同种分子形成的二聚体称同二聚体，异种分子间形成的二聚体称异二聚体.这种多聚体的形成是转录因子上的寡聚化位点 (oligomerization site) 相互作用的结果，寡聚化位点的氨基酸序列很保守，大多与DNA结合区相连并形成一定的空间构象.除二聚化或多聚化反应，还有一些调节蛋白不能直接结合DNA，而是通过蛋白质－蛋白质相互作用间接结合DNA，调节基因转录，这样就形成了一个表达调控的复合物. 转录因子的作用是通过和顺式因子的互作来实现的.这段序列可以和转录因子的DNA结合域实现共价结合，从而对基因的表达起YZ或增强的作用.

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如何利用pymol分析受体与配体结合位点的氨基酸:

转录组测序结合蛋白质组分析探索蝾螈再生奥秘: 来自德国及美国等处的研究人员针对基因组特别大，难以进行全基因组测序的动物，提出了以转录组测序与蛋白质组分析联合以解析功能基因的策略，并以蝾螈进行实验，开辟了组织及器官再生研究的新思路。该研究成果已发表近期的《Genome Biology》杂志上。蝾螈是一种在侏罗纪中期演化的有尾两栖动物，目前存活的约有400种。红色斑点蝾螈虽然小，但其组织工程学技艺却令人惊叹。蝾螈在失去了组织，包括心肌、神经系统元件甚至眼睛的晶状体后仍能再生。一般来讲，动物的再生组织的能力是所有多细胞动物所共有的古老程序，因此，医生们一直希望蝾螈的这种能力依赖于基础遗传学程序，而该程序潜伏在包括哺乳动物在内的所有动物中，这样他们就可以在再生医学中利用蝾螈的再生机制。

然而蝾螈的基因组十分庞大，比人类基因组大十倍，要从头获得蝾螈的全基因组序列不容易。因此研究者们将目光转向基因表达所产生的RNA，他们利用454新一代测序技术对蝾螈的转录组进行了研究。经过从头组装N. viridescens的转录组，获得了超过120,000个RNA转录本，约有15,000个转录本编码蛋白质，其中有826个转录本是蝾螈所特有的。这些转录本中包含了不同器官所有再生阶段的转录本，这些转录本中的一部分与其它生物相似。通过对蝾螈胚胎和幼体的心脏、四肢、眼睛、尾、肝脏、等组织中再生过程表达的蛋白的分离以及质谱分析方法，对这些蛋白进行分类及与转录本的比对。

通过454新一代测序结果与质谱技术的结合，发现了500多个其它生物中从未被发现的肽段，接下来会进一步探索这些蛋白是否与再生能力相关。这项研究不仅为目前科学家们提供了两栖类动物的基因数据，更为基因组测序困难的动物研究，提出了一种新思路。

参考文献：
Genome Biol. 2013 Feb 20;14(2):R16. A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration.Looso M, Preussner J, Sousounis K, Bruckskotten M, Michel CS, Lignelli E, Reinhardt R, Hoeffner S, Krueger M, Tsonis PA, Borchardt T, Braun T.

转录因子控制细胞表面蛋白“组合编码”

细胞核内的转录因子是决定细胞命运、形态、和生理功能的中心指挥者，而在细胞膜表面的蛋白则通过与细胞环境的相互作用来执行这些指令。“转录因子→细胞表面蛋白→生理功能”的框架被认为存在于一切涉及细胞与环境交流的生物学过程中。例如在发育的神经元中，科学家们常常假设转录因子通过调节细胞表面蛋白的表达，来控制神经元之间连接，形成特定的神经环路。

2022年5月24日，来自美国斯坦福大学与霍华德休斯医学研究所的知名学者骆利群教授，带领团队在Neuron期刊上发表研究论文，用一个定义谱系的转录因子Acj6为例子，展示了转录因子如何“四两拨千斤”，通过调节不同组合的表面蛋白的表达，控制不同神经元类型的连接。骆利群实验室的博士生谢琦婧和李介夫博士为本文的共同***作者。

早在2003年，骆利群教授团队发现转录因子Acj6特异性表达在果蝇嗅觉系统投射神经元（projection neuron，PN）的一个谱系（lineage）中，并控制这些神经元特异性的树突靶向。不过，当时由于缺少直接测量特定细胞群体表面蛋白表达的方法，无法进一步知道Acj6以及其他转录因子如何通过细胞表面的蛋白质控制神经连接的特异性。

直到2020年，骆利群教授、本文的共同***作者李介夫博士与合作者发展了一种高时空分辨率的蛋白组学技术，在方法上实现了突破。这种技术使得研究人员可以直接在完整果蝇大脑内对指定细胞类型的表面蛋白组进行高精度的生物素标记、富集和分析，也为系统地研究转录因子如何在多细胞生物的完整组织中塑造细胞表面蛋白质组提供了可能。

▲相关阅读：骆利群/Alice Ting联合团队《细胞》发文，创新技术找到多个神经连接调节因子

在此次新研究中，研究人员运用这种蛋白组学技术，首先找到了转录因子Acj6调节哪些细胞表面蛋白来执行它的命令。他们分别在野生态和acj6功能丧失突变体中，对投射神经元进行了表面蛋白组的定量分析，然后基于蛋白组学的数据进行体内筛选，由此揭示了许多执行Acj6连接指示的分子。

这些表面蛋白有一些正如作者的猜测，属于细胞粘附分子，但还有一些则令人意外。比如，机械敏感离子通道Piezo。这种蛋白传统上被认为只介导神经元功能，但他们发现，失去机械敏感离子通道活性的Piezo突变体可以与野生型Piezo一样精准调控PN树突靶向。“这个结果***展示了Piezo独立于机械感觉离子通道的功能。”作者指出。

▲在PN中敲除Piezo导致树突错误的靶向（白色箭头）

接下来，为了建立转录因子Acj6与其调控的表面蛋白在树突靶向中的功能性联系，研究人员在表达Acj6的投射神经元中特异性地敲除了acj6，同时又在这些神经元中特异性地表达了Acj6促进表达的表面蛋白。

实验结果表明，在不同神经元类型中，Acj6通过调控不同组合的表面蛋白表达来指定这类神经元特异的靶向。

“在不同神经元中，一个转录因子是通过调节相同、还是不同的细胞表面蛋白以指定它们的特异连接，这个问题过去并不清楚。”研究人员指出，“发育神经生物学长期存在一种假设，认为神经连接的特异性可能是由表面蛋白组合编码（combinatorial code）控制，现在我们***为这一假设提供了实验证据，展示了表面蛋白间的遗传相互作用模式（加法、减法和协同）。”

▲Acj6在不同神经元类型中通过调控不同表面蛋白（cell-surface executor）的表达来控制神经连接特异性

正如科学家们在论文中提及的那样，这篇文章为未来研究转录因子功能与机理提出了一个新的策略和方法的原型。

RNA提取磁珠属于纳米生物磁珠的一种，主要作用是用于核酸提取过程中的RNA提取，粒径分布在500nm左右，是洛阳吉恩特生物自主研发生产的高分子纳米磁性微球，该磁珠悬浮时间长，磁响应时间迅速，对DNA甲基化过程中的提取环节提供良好的支持，可明显缩短实验时间，提高实验效率，并在提取结果上保持稳定，配合核酸提取仪，更能实现快速的RNA提取。

2022-06-13 09:09:42 156 0